Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Τα θερμόφιλα είναι μικροοργανισμοί που ευδοκιμούν σε υψηλές θερμοκρασίες. Η μελέτη τους μπορεί να δώσει πολύτιμες πληροφορίες για το πώς η ζωή προσαρμόζεται σε ακραίες συνθήκες. Ωστόσο, είναι δύσκολο να επιτευχθούν συνθήκες υψηλής θερμοκρασίας με τα συμβατικά οπτικά μικροσκόπια. Έχουν προταθεί αρκετές οικιακές λύσεις που βασίζονται σε τοπική ηλεκτρική θέρμανση με αντίσταση, αλλά δεν υπάρχει απλή εμπορική λύση. Σε αυτό το άρθρο, εισάγουμε την έννοια της θέρμανσης με λέιζερ μικροκλίμακας πάνω από το οπτικό πεδίο του μικροσκοπίου για την παροχή υψηλών θερμοκρασιών για μελέτες θερμόφιλων, διατηρώντας παράλληλα ήπιο το περιβάλλον του χρήστη. Η θέρμανση σε μικροκλίμακα σε μέτρια ένταση λέιζερ μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας ένα υπόστρωμα επικαλυμμένο με νανοσωματίδια χρυσού ως βιοσυμβατό και αποτελεσματικό απορροφητή φωτός. Συζητούνται πιθανές επιδράσεις της μεταφοράς υγρού σε μικροκλίμακα, της κατακράτησης κυττάρων και της φυγοκεντρικής θερμοφορητικής κίνησης. Η μέθοδος έχει αποδειχθεί σε δύο είδη: (i) Geobacillus stearothermophilus, ένα ενεργό θερμόφιλο βακτήριο που αναπαράγεται περίπου στους 65°C, το οποίο έχουμε παρατηρήσει ότι βλασταίνει, αναπτύσσεται και κολυμπά υπό θέρμανση σε μικροκλίμακα. (ii) Thiobacillus sp., μια βέλτιστα υπερθερμόφιλη αρχαία. στους 80°C. Αυτή η εργασία ανοίγει το δρόμο για απλή και ασφαλή παρατήρηση θερμόφιλων μικροοργανισμών χρησιμοποιώντας σύγχρονα και οικονομικά εργαλεία μικροσκοπίας.
Κατά τη διάρκεια δισεκατομμυρίων ετών, η ζωή στη Γη έχει εξελιχθεί ώστε να προσαρμόζεται σε ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών συνθηκών που μερικές φορές θεωρούνται ακραίες από την ανθρώπινη προοπτική μας. Συγκεκριμένα, ορισμένοι θερμόφιλοι μικροοργανισμοί (βακτήρια, αρχαία, μύκητες) που ονομάζονται θερμόφιλα ευδοκιμούν στο εύρος θερμοκρασιών από 45°C έως 122°C1, 2, 3, 4. Τα θερμόφιλα ζουν σε διάφορα οικοσυστήματα, όπως υδροθερμικές πηγές βαθέων υδάτων, θερμές πηγές ή ηφαιστειακές περιοχές. Η έρευνά τους έχει προκαλέσει μεγάλο ενδιαφέρον τις τελευταίες δεκαετίες για τουλάχιστον δύο λόγους. Πρώτον, μπορούμε να μάθουμε από αυτά, για παράδειγμα, πώς τα θερμόφιλα 5, 6, τα ένζυμα 7, 8 και οι μεμβράνες 9 είναι σταθερά σε τόσο υψηλές θερμοκρασίες ή πώς τα θερμόφιλα μπορούν να αντέξουν ακραία επίπεδα ακτινοβολίας10. Δεύτερον, αποτελούν τη βάση για πολλές σημαντικές βιοτεχνολογικές εφαρμογές1,11,12 όπως η παραγωγή καυσίμων13,14,15,16, η χημική σύνθεση (διυδρο, αλκοόλες, μεθάνιο, αμινοξέα κ.λπ.)17, η βιοεξόρυξη18 και οι θερμοσταθεροί βιοκαταλύτες7,11, 13. Συγκεκριμένα, η επί του παρόντος γνωστή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)19 περιλαμβάνει ένα ένζυμο (Taq πολυμεράση) που απομονώθηκε από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus, ένα από τα πρώτα θερμόφιλα που ανακαλύφθηκαν.
Ωστόσο, η μελέτη των θερμόφιλων δεν είναι εύκολη υπόθεση και δεν μπορεί να αυτοσχεδιαστεί σε κανένα βιολογικό εργαστήριο. Ειδικότερα, τα ζωντανά θερμόφιλα δεν μπορούν να παρατηρηθούν in vitro με οποιοδήποτε τυπικό μικροσκόπιο φωτός, ακόμη και με εμπορικά διαθέσιμους θαλάμους θέρμανσης, που συνήθως χαρακτηρίζονται για θερμοκρασίες έως και 40°C. Από τη δεκαετία του 1990, μόνο λίγες ερευνητικές ομάδες έχουν αφιερωθεί στην εισαγωγή συστημάτων μικροσκοπίας υψηλής θερμοκρασίας (HTM). Το 1994 οι Glukh et al. Ο θάλαμος θέρμανσης/ψύξης σχεδιάστηκε με βάση τη χρήση μιας κυψέλης Peltier που ελέγχει τη θερμοκρασία των ορθογώνιων τριχοειδών αγγείων που είναι κλειστά για τη διατήρηση της αναερόβιας 20 . Η συσκευή μπορεί να θερμανθεί έως τους 100 °C με ρυθμό 2 °C/s, επιτρέποντας στους συγγραφείς να μελετήσουν την κινητικότητα του υπερθερμοφιλικού βακτηρίου Thermotoga maritima21. Το 1999 οι Horn et al. Έχει αναπτυχθεί μια πολύ παρόμοια συσκευή, η οποία εξακολουθεί να βασίζεται στη χρήση θερμαινόμενων τριχοειδών αγγείων κατάλληλων για εμπορική μικροσκοπία για τη μελέτη της κυτταρικής διαίρεσης/σύνδεσης. Μετά από μια μακρά περίοδο σχετικής αδράνειας, η αναζήτηση για αποτελεσματικά HTM ξανάρχισε το 2012, ιδίως σε σχέση με μια σειρά εγγράφων από την ομάδα Wirth που χρησιμοποίησε μια συσκευή που εφευρέθηκε από τους Horn et al. Πριν από δεκαπέντε χρόνια, η κινητικότητα ενός μεγάλου αριθμού αρχαίων, συμπεριλαμβανομένων των υπερθερμοφίλων, μελετήθηκε σε θερμοκρασίες έως 100°C χρησιμοποιώντας θερμαινόμενα τριχοειδή αγγεία23,24. Τροποποίησαν επίσης το αρχικό μικροσκόπιο για να επιτύχουν ταχύτερη θέρμανση (αρκετά λεπτά αντί για 35 λεπτά για να επιτευχθεί η καθορισμένη θερμοκρασία) και να επιτύχουν μια γραμμική διαβάθμιση θερμοκρασίας μεγαλύτερη από 2 cm σε όλο το μέσο. Αυτή η συσκευή διαμόρφωσης κλίσης θερμοκρασίας (TGFD) έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της κινητικότητας πολλών θερμόφιλων εντός διαβαθμίσεων θερμοκρασίας σε βιολογικά σχετικές αποστάσεις 24, 25 .
Η θέρμανση των κλειστών τριχοειδών αγγείων δεν είναι ο μόνος τρόπος παρατήρησης των ζωντανών θερμόφιλων. Το 2012, οι Kuwabara et al. Χρησιμοποιήθηκαν σπιτικοί θάλαμοι μιας χρήσης Pyrex σφραγισμένοι με ανθεκτική στη θερμότητα κόλλα (Super X2, Cemedine, Ιαπωνία). Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε διαφανή θερμαντική πλάκα που διατίθεται στο εμπόριο (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) ικανή να θερμανθεί μέχρι τους 110°C, αλλά δεν προοριζόταν αρχικά για βιοαπεικόνιση. Οι συγγραφείς παρατήρησαν αποτελεσματική διαίρεση αναερόβιων θερμόφιλων βακτηρίων (Thermosipho globiformans, χρόνος διπλασιασμού 24 λεπτά) στους 65°C. Το 2020, οι Pulshen et al. Η αποτελεσματική θέρμανση εμπορικών μεταλλικών πιάτων (AttofluorTM, Thermofisher) αποδείχθηκε χρησιμοποιώντας δύο αυτοσχέδια θερμαντικά στοιχεία: ένα καπάκι και ένα στάδιο (διαμόρφωση εμπνευσμένη από μηχανή PCR). Αυτή η σύνδεση έχει ως αποτέλεσμα μια ομοιόμορφη θερμοκρασία υγρού και αποτρέπει την εξάτμιση και τη συμπύκνωση στο κάτω μέρος του καπακιού. Η χρήση O-ring αποφεύγει την ανταλλαγή αερίων με το περιβάλλον. Αυτό το HTM, που ονομάζεται Sulfoscope, χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση του Sulfolobus acidocaldarius στους 75°C27.
Ένας αναγνωρισμένος περιορισμός όλων αυτών των συστημάτων ήταν ο περιορισμός στη χρήση αντικειμένων αέρα, καθώς οποιαδήποτε εμβάπτιση λαδιού ήταν ακατάλληλη για τόσο υψηλή θερμοκρασία και για απεικόνιση μέσω διαφανών δειγμάτων πάχους >1 mm. Ένας αναγνωρισμένος περιορισμός όλων αυτών των συστημάτων ήταν ο περιορισμός στη χρήση αντικειμένων αέρα, καθώς οποιαδήποτε εμβάπτιση λαδιού ήταν ακατάλληλη για τόσο υψηλή θερμοκρασία και για απεικόνιση μέσω διαφανών δειγμάτων πάχους >1 mm. , 1 mm. Ένα αναγνωρισμένο μειονέκτημα όλων αυτών των συστημάτων ήταν ο περιορισμός στη χρήση αντικειμένων αέρα, καθώς οποιαδήποτε εμβάπτιση λαδιού δεν ήταν κατάλληλη για τόσο υψηλή θερμοκρασία και για οπτικοποίηση μέσω διαφανών δειγμάτων πάχους > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合用空气物镜，任何油浸都不适合迁毫米厚的透明样品成像。 Ένας αναγνωρισμένος περιορισμός όλων αυτών των συστημάτων είναι ο περιορισμός της χρήσης καθρέφτη με αερισμό, καθώς οποιαδήποτε εμβάπτιση λαδιού είναι ακατάλληλη για απεικόνιση διαφανών δειγμάτων πάχους >1 mm σε τόσο υψηλές θερμοκρασίες. Ο χρήστης δεν έχει συμπληρώσει το σύστημα αυτό είναι περιορισμένο ως προς την χρήση του αερόβιο, αλλά δεν είναι κατάλληλο για τον έλεγχο της θερμοκρασίας >1. Ένα αναγνωρισμένο μειονέκτημα όλων αυτών των συστημάτων είναι η περιορισμένη χρήση αεροφακών, οποιαδήποτε εμβάπτιση λαδιού είναι ακατάλληλη για τόσο υψηλές θερμοκρασίες και οπτικοποίηση μέσω διαφανών δειγμάτων πάχους >1 mm.Πιο πρόσφατα, αυτός ο περιορισμός άρθηκε από τους Charles-Orzag et al. 28, ο οποίος ανέπτυξε μια συσκευή που δεν παρέχει πλέον θερμότητα γύρω από το σύστημα ενδιαφέροντος, αλλά μάλλον μέσα στο ίδιο το γυαλί καλύμματος, καλυμμένο με ένα λεπτό διαφανές στρώμα αντίστασης από ITO (οξείδιο ινδίου-κασσιτέρου). Το καπάκι μπορεί να θερμανθεί μέχρι τους 75 °C περνώντας ηλεκτρικό ρεύμα μέσα από το διαφανές στρώμα. Ωστόσο, ο συγγραφέας πρέπει επίσης να θερμάνει τον φακό στον αντικειμενικό φακό, αλλά όχι περισσότερο από 65 °C, για να μην τον βλάψει.
Αυτές οι εργασίες δείχνουν ότι η ανάπτυξη αποτελεσματικής οπτικής μικροσκοπίας υψηλής θερμοκρασίας δεν έχει υιοθετηθεί ευρέως, συχνά απαιτεί σπιτικό εξοπλισμό και συχνά επιτυγχάνεται με κόστος χωρικής ανάλυσης, γεγονός που αποτελεί σοβαρό μειονέκτημα δεδομένου ότι οι θερμόφιλοι μικροοργανισμοί δεν είναι μεγαλύτεροι από λίγους μικρόμετρα. Ο μειωμένος όγκος θέρμανσης είναι το κλειδί για την επίλυση τριών εγγενών προβλημάτων του HTM: κακή χωρική ανάλυση, υψηλή θερμική αδράνεια όταν το σύστημα θερμαίνεται και επιβλαβής θέρμανση των γύρω στοιχείων (πετρέλαιο εμβάπτισης, αντικειμενικός φακός… ή τα χέρια του χρήστη) σε ακραίες θερμοκρασίες. ).
Σε αυτό το άρθρο, εισάγουμε ένα HTM για παρατήρηση θερμόφιλων που δεν βασίζεται σε θέρμανση με αντίσταση. Αντίθετα, πετύχαμε τοπική θέρμανση σε μια περιορισμένη περιοχή του οπτικού πεδίου του μικροσκοπίου με ακτινοβολία λέιζερ ενός υποστρώματος που απορροφά το φως. Η κατανομή της θερμοκρασίας απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική μικροσκοπία φάσης (QPM). Η αποτελεσματικότητα αυτής της μεθόδου αποδεικνύεται από το Geobacillus stearothermophilus, ένα κινητικό θερμόφιλο βακτήριο που αναπαράγεται στους 65°C περίπου και έχει μικρό χρόνο διπλασιασμού (περίπου 20 λεπτά) και το Sulfolobus shibatae, ένα υπερθερμόφιλο που αναπτύσσεται βέλτιστα στους 80°C (archae) για να εικονογραφήσουμε. Ο κανονικός ρυθμός αντιγραφής και η κολύμβηση παρατηρήθηκαν ως συνάρτηση της θερμοκρασίας. Αυτό το λέιζερ HTM (LA-HTM) δεν περιορίζεται από το πάχος της καλυπτρίδας ή από τη φύση του αντικειμενικού φακού (βύθιση με αέρα ή λάδι). Αυτό επιτρέπει τη χρήση οποιουδήποτε φακού υψηλής ανάλυσης στην αγορά. Επίσης δεν υποφέρει από αργή θέρμανση λόγω θερμικής αδράνειας (επιτυγχάνει άμεση θέρμανση σε κλίμακα χιλιοστού του δευτερολέπτου) και χρησιμοποιεί μόνο εξαρτήματα που διατίθενται στο εμπόριο. Οι μόνες νέες ανησυχίες για την ασφάλεια σχετίζονται με την παρουσία ισχυρών ακτίνων λέιζερ (συνήθως έως 100 mW) μέσα στη συσκευή και πιθανώς μέσω των ματιών, οι οποίες απαιτούν προστατευτικά γυαλιά.
Η αρχή του LA-HTM είναι η χρήση λέιζερ για τη θέρμανση του δείγματος τοπικά εντός του οπτικού πεδίου του μικροσκοπίου (Εικ. 1α). Για να γίνει αυτό, το δείγμα πρέπει να απορροφά το φως. Για να χρησιμοποιήσουμε μια λογική ισχύ λέιζερ (λιγότερη από 100 mW), δεν βασιστήκαμε στην απορρόφηση φωτός από το υγρό μέσο, αλλά αυξήσαμε τεχνητά την απορρόφηση του δείγματος επικαλύπτοντας το υπόστρωμα με νανοσωματίδια χρυσού (Εικ. 1γ). Η θέρμανση νανοσωματιδίων χρυσού με φως είναι θεμελιώδους σημασίας για τον τομέα της θερμικής πλασμονικής, με αναμενόμενες εφαρμογές στη βιοϊατρική, τη νανοχημεία ή τη συλλογή του ηλιακού φωτός29,30,31. Τα τελευταία χρόνια, χρησιμοποιήσαμε αυτό το LA-HTM σε αρκετές μελέτες που σχετίζονται με εφαρμογές θερμικού πλάσματος στη φυσική, τη χημεία και τη βιολογία. Η κύρια δυσκολία με αυτή τη μέθοδο είναι η εμφάνιση του τελικού προφίλ θερμοκρασίας, καθώς η αυξημένη θερμοκρασία περιορίζεται σε μια περιοχή μικροκλίμακα μέσα στο δείγμα. Δείξαμε ότι η χαρτογράφηση θερμοκρασίας μπορεί να επιτευχθεί με το συμβολόμετρο εγκάρσιας διάτμησης τεσσάρων μηκών κύματος, μια απλή, υψηλής ανάλυσης και πολύ ευαίσθητη μέθοδο ποσοτικής μικροσκοπίας φάσης που βασίζεται στη χρήση δισδιάστατων δικτυωμάτων περίθλασης (γνωστά και ως εγκάρσια πλέγματα) 33,34,35,36. Η αξιοπιστία αυτής της τεχνικής θερμικής μικροσκοπίας, που βασίζεται στη μικροσκοπία μετώπου κύματος διασταυρούμενου πλέγματος (CGM), έχει αποδειχθεί σε δώδεκα εργασίες που δημοσιεύθηκαν την τελευταία δεκαετία37,38,39,40,41,42,43.
Σχέδιο εγκατάστασης παράλληλου μικροσκοπίου θέρμανσης, διαμόρφωσης και θερμοκρασίας λέιζερ. β Γεωμετρία δείγματος που αποτελείται από θάλαμο AttofluorTM που περιέχει καλυπτρίδα επικαλυμμένη με νανοσωματίδια χρυσού. γ Κοιτάξτε προσεκτικά το δείγμα (όχι σε κλίμακα). Το d αντιπροσωπεύει το ομοιόμορφο προφίλ δέσμης λέιζερ και (ε) την προσομοιωμένη επακόλουθη κατανομή θερμοκρασίας στο επίπεδο δείγματος των νανοσωματιδίων χρυσού. Το f είναι ένα προφίλ δακτυλιοειδούς δέσμης λέιζερ κατάλληλο για τη δημιουργία ομοιόμορφης θερμοκρασίας όπως φαίνεται στην προσομοίωση της προκύπτουσας κατανομής θερμοκρασίας που φαίνεται στο (g). Μπάρα κλίμακας: 30 μm.
Συγκεκριμένα, επιτύχαμε πρόσφατα θέρμανση κυττάρων θηλαστικών με LA-HTM και CGM και παρακολουθήσαμε αποκρίσεις κυτταρικού θερμικού σοκ στην περιοχή 37-42°C, αποδεικνύοντας την εφαρμογή αυτής της τεχνικής στην απεικόνιση μεμονωμένων ζωντανών κυττάρων. Ωστόσο, η εφαρμογή του LA-HTM στη μελέτη μικροοργανισμών σε υψηλές θερμοκρασίες δεν είναι σαφής, καθώς απαιτεί μεγαλύτερη προσοχή σε σύγκριση με τα κύτταρα θηλαστικών: πρώτον, η θέρμανση του πυθμένα του μέσου κατά δεκάδες βαθμούς (αντί για λίγους βαθμούς) οδηγεί σε μια ισχυρή κατακόρυφη κλίση θερμοκρασίας. μπορεί να δημιουργήσει μεταφορά ρευστού 44 η οποία, εάν δεν προσκολληθεί σταθερά στο υπόστρωμα, μπορεί να προκαλέσει ανεπιθύμητη κίνηση και ανάμειξη βακτηρίων. Αυτή η μεταφορά μπορεί να εξαλειφθεί με τη μείωση του πάχους του υγρού στρώματος. Για το σκοπό αυτό, σε όλα τα πειράματα που παρουσιάζονται παρακάτω, βακτηριακά εναιωρήματα τοποθετήθηκαν ανάμεσα σε δύο καλυπτρίδες πάχους περίπου 15 μm τοποθετημένες μέσα σε μεταλλικό κύπελλο (AttofluorTM, Thermofisher, Σχήμα 1b,c). Κατ' αρχήν, η μεταφορά μπορεί να αποφευχθεί εάν το πάχος του υγρού είναι μικρότερο από το μέγεθος της δέσμης του θερμαντικού λέιζερ. Δεύτερον, η εργασία σε μια τόσο περιορισμένη γεωμετρία μπορεί να καταπνίξει αερόβιους οργανισμούς (βλ. Εικ. S2). Αυτό το πρόβλημα μπορεί να αποφευχθεί χρησιμοποιώντας ένα υπόστρωμα που είναι διαπερατό από το οξυγόνο (ή οποιοδήποτε άλλο ζωτικό αέριο), αφήνοντας παγιδευμένες φυσαλίδες αέρα μέσα στην καλυπτρίδα ή ανοίγοντας οπές στην επάνω καλυπτρίδα (βλ. Εικ. S1) 45 . Σε αυτή τη μελέτη, επιλέξαμε την τελευταία λύση (Εικόνες 1β και S1). Τέλος, η θέρμανση με λέιζερ δεν παρέχει ομοιόμορφη κατανομή θερμοκρασίας. Ακόμη και στην ίδια ένταση της δέσμης λέιζερ (Εικ. 1δ), η κατανομή της θερμοκρασίας δεν είναι ομοιόμορφη, αλλά μάλλον μοιάζει με την κατανομή Gauss λόγω της θερμικής διάχυσης (Εικ. 1ε). Όταν ο στόχος είναι να καθοριστούν ακριβείς θερμοκρασίες στο οπτικό πεδίο για τη μελέτη βιολογικών συστημάτων, τα ανομοιόμορφα προφίλ δεν είναι ιδανικά και μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε θερμοφορητική κίνηση βακτηρίων εάν δεν προσκολλώνται στο υπόστρωμα (βλ. Εικ. S3, S4)39. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε έναν διαμορφωτή χωρικού φωτός (SLM) για να διαμορφώσουμε την υπέρυθρη δέσμη λέιζερ σύμφωνα με το σχήμα του δακτυλίου (Εικ. 1στ) στο επίπεδο του δείγματος για να επιτύχουμε μια απόλυτα ομοιόμορφη κατανομή θερμοκρασίας σε μια δεδομένη γεωμετρική περιοχή. παρά τη θερμική διάχυση (Εικ. 1δ) 39 , 42, 46. Τοποθετήστε μια επάνω καλυπτρίδα πάνω από ένα μεταλλικό πιάτο (Εικόνα 1β) για να αποφύγετε την εξάτμιση του μέσου και παρατηρήστε για τουλάχιστον μερικές ημέρες. Επειδή αυτή η άνω καλυπτρίδα δεν είναι σφραγισμένη, μπορεί εύκολα να προστεθεί επιπλέον μέσο ανά πάσα στιγμή, εάν είναι απαραίτητο.
Για να δείξουμε πώς λειτουργεί το LA-HTM και να αποδείξουμε την εφαρμογή του στη θερμόφιλη έρευνα, μελετήσαμε τα αερόβια βακτήρια Geobacillus stearothermophilus, τα οποία έχουν βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης περίπου 60-65°C. Το βακτήριο έχει επίσης μαστίγια και την ικανότητα να κολυμπάει, παρέχοντας έναν ακόμη δείκτη της φυσιολογικής κυτταρικής δραστηριότητας.
Τα δείγματα (Εικ. 1β) προεπωάστηκαν στους 60°C για μία ώρα και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε θήκη δειγμάτων LA-HTM. Αυτή η προεπώαση είναι προαιρετική, αλλά εξακολουθεί να είναι χρήσιμη, για δύο λόγους: Πρώτον, όταν το λέιζερ είναι ενεργοποιημένο, προκαλεί την άμεση ανάπτυξη και διαίρεση των κυττάρων (δείτε την ταινία M1 στα Συμπληρωματικά Υλικά). Χωρίς προεπώαση, η βακτηριακή ανάπτυξη συνήθως καθυστερεί κατά περίπου 40 λεπτά κάθε φορά που θερμαίνεται μια νέα περιοχή προβολής στο δείγμα. Δεύτερον, η 1 ώρα προεπώασης προώθησε την προσκόλληση των βακτηρίων στην καλυπτρίδα, εμποδίζοντας τα κύτταρα να παρασυρθούν από το οπτικό πεδίο λόγω θερμοφόρησης όταν το λέιζερ ενεργοποιήθηκε (βλ. φιλμ M2 στα Συμπληρωματικά Υλικά). Η θερμοφόρηση είναι η κίνηση σωματιδίων ή μορίων κατά μήκος μιας βαθμίδας θερμοκρασίας, συνήθως από το θερμό στο κρύο, και τα βακτήρια δεν αποτελούν εξαίρεση43,47. Αυτή η ανεπιθύμητη ενέργεια εξαλείφεται σε μια δεδομένη περιοχή με τη χρήση SLM για τη διαμόρφωση της δέσμης λέιζερ και την επίτευξη επίπεδης κατανομής θερμοκρασίας.
Στο σχ. Το Σχήμα 2 δείχνει την κατανομή θερμοκρασίας που μετρήθηκε με CGM που λαμβάνεται με ακτινοβόληση ενός γυάλινου υποστρώματος επικαλυμμένου με νανοσωματίδια χρυσού με μια δακτυλιοειδή δέσμη λέιζερ (Εικ. 1στ). Παρατηρήθηκε μια επίπεδη κατανομή θερμοκρασίας σε ολόκληρη την περιοχή που καλύπτεται από τη δέσμη λέιζερ. Αυτή η ζώνη ορίστηκε στους 65°C, τη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης. Έξω από αυτήν την περιοχή, η καμπύλη θερμοκρασίας πέφτει φυσικά στο \(1/r\) (όπου \(r\) είναι η ακτινική συντεταγμένη).
ένας χάρτης θερμοκρασίας των μετρήσεων CGM που ελήφθη χρησιμοποιώντας μια δακτυλιοειδή δέσμη λέιζερ για την ακτινοβολία ενός στρώματος νανοσωματιδίων χρυσού για να ληφθεί ένα επίπεδο προφίλ θερμοκρασίας σε μια κυκλική περιοχή. β Ισόθερμος του χάρτη θερμοκρασίας (α). Το περίγραμμα της δέσμης λέιζερ αντιπροσωπεύεται από έναν γκρι διακεκομμένο κύκλο. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές (βλέπε Συμπληρωματικά Υλικά, Εικόνα S4).
Η βιωσιμότητα των βακτηριακών κυττάρων παρακολουθήθηκε για αρκετές ώρες χρησιμοποιώντας LA-HTM. Στο σχ. Το 3 δείχνει το χρονικό διάστημα για τέσσερις εικόνες που λαμβάνονται από ταινία 3 ωρών και 20 λεπτών (Ταινία M3, Συμπληρωματικές πληροφορίες). Παρατηρήθηκε ότι τα βακτήρια πολλαπλασιάζονται ενεργά εντός της κυκλικής περιοχής που ορίζεται από το λέιζερ όπου η θερμοκρασία ήταν βέλτιστη, πλησιάζοντας τους 65°C. Αντίθετα, η ανάπτυξη των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά όταν η θερμοκρασία έπεσε κάτω από τους 50°C για 10 δευτερόλεπτα.
Εικόνες οπτικού βάθους των βακτηρίων G. stearothermophilus που αναπτύσσονται μετά από θέρμανση με λέιζερ σε διαφορετικούς χρόνους, (α) t = 0 λεπτά, (β) 1 ώρα και 10 λεπτά, (γ) 2 ώρες και 20 λεπτά, (δ) 3 ώρες και 20 λεπτά, από 200 Εξάγεται από φιλμ ενός λεπτού (φιλμ M3 που παρέχεται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες) που τοποθετείται πάνω στον αντίστοιχο χάρτη θερμοκρασίας. Το λέιζερ ενεργοποιείται τη στιγμή \(t=0\). Στην εικόνα έντασης έχουν προστεθεί ισόθερμες.
Για να ποσοτικοποιήσουμε περαιτέρω την ανάπτυξη των κυττάρων και την εξάρτησή της από τη θερμοκρασία, μετρήσαμε την αύξηση της βιομάζας διαφόρων αποικιών αρχικά απομονωμένων βακτηρίων στο οπτικό πεδίο Movie M3 (Εικ. 4). Τα μητρικά βακτήρια που επιλέχθηκαν κατά την έναρξη του σχηματισμού μονάδας σχηματισμού μίνι αποικίας (mCFU) φαίνονται στο Σχήμα S6. Έγιναν μετρήσεις ξηρής μάζας με κάμερα CGM 48 που χρησιμοποιήθηκε για τη χαρτογράφηση της κατανομής θερμοκρασίας. Η ικανότητα του CGM να μετράει το ξηρό βάρος και τη θερμοκρασία είναι η δύναμη του LA-HTM. Όπως αναμενόταν, η υψηλή θερμοκρασία προκάλεσε ταχύτερη βακτηριακή ανάπτυξη (Εικ. 4α). Όπως φαίνεται στην ημι-λογαριθμική γραφική παράσταση στο Σχ. 4β, η ανάπτυξη σε όλες τις θερμοκρασίες ακολουθεί την εκθετική ανάπτυξη, όπου τα δεδομένα χρησιμοποιούν την εκθετική συνάρτηση \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), όπου \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – χρόνος παραγωγής (ή χρόνος διπλασιασμού), \( g =1/ \tau\) – ρυθμός ανάπτυξης (αριθμός διαιρέσεων ανά μονάδα χρόνου ). Στο σχ. Το σχήμα 4c δείχνει τον αντίστοιχο ρυθμό ανάπτυξης και το χρόνο παραγωγής ως συνάρτηση της θερμοκρασίας. Τα ταχέως αναπτυσσόμενα mCFU χαρακτηρίζονται από κορεσμό της ανάπτυξης μετά από δύο ώρες, μια αναμενόμενη συμπεριφορά λόγω της υψηλής βακτηριακής πυκνότητας (παρόμοια με τη στατική φάση στις κλασικές υγρές καλλιέργειες). Το γενικό σχήμα \(g\left(T\right)\) (Εικ. 4c) αντιστοιχεί στην αναμενόμενη καμπύλη δύο φάσεων για το G. stearothermophilus με βέλτιστο ρυθμό ανάπτυξης γύρω στους 60-65°C. Αντιστοιχίστε τα δεδομένα χρησιμοποιώντας ένα βασικό μοντέλο (Εικόνα S5)49 όπου \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, το οποίο συμφωνεί καλά με άλλες τιμές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία49. Αν και οι παράμετροι που εξαρτώνται από τη θερμοκρασία είναι αναπαραγώγιμες, ο μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης του \({G}_{0}\) μπορεί να διαφέρει από το ένα πείραμα στο άλλο (δείτε εικόνες S7-S9 και ταινία M4). Σε αντίθεση με τις παραμέτρους προσαρμογής θερμοκρασίας, οι οποίες θα πρέπει να είναι καθολικές, ο μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης εξαρτάται από τις ιδιότητες του μέσου (διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών, συγκέντρωση οξυγόνου) εντός της παρατηρούμενης γεωμετρίας μικροκλίμακας.
μια μικροβιακή ανάπτυξη σε διάφορες θερμοκρασίες. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Δεδομένα που ελήφθησαν από ένα βίντεο ενός μεμονωμένου βακτηρίου που αναπτύσσεται σε μια διαβάθμιση θερμοκρασίας (ταινία M3). β Ίδιο με το (a), ημιλογαριθμική κλίμακα. c Ρυθμός ανάπτυξης\(\tau\) και χρόνος δημιουργίας\(g\) που υπολογίζονται από τη γραμμική παλινδρόμηση (b). Οριζόντιες ράβδοι σφάλματος: εύρος θερμοκρασίας στο οποίο τα mCFU επεκτάθηκαν στο οπτικό πεδίο κατά την ανάπτυξη. Κάθετες γραμμές σφάλματος: τυπικό σφάλμα γραμμικής παλινδρόμησης.
Εκτός από την κανονική ανάπτυξη, ορισμένα βακτήρια έπλεαν μερικές φορές στη θέα κατά τη θέρμανση με λέιζερ, κάτι που είναι μια αναμενόμενη συμπεριφορά για βακτήρια με μαστίγια. Η ταινία Μ5 σε πρόσθετες πληροφορίες δείχνει τέτοιες κολυμβητικές δραστηριότητες. Σε αυτό το πείραμα, χρησιμοποιήθηκε ομοιόμορφη ακτινοβολία λέιζερ για τη δημιουργία μιας βαθμίδας θερμοκρασίας, όπως φαίνεται στα Σχήματα 1d, e και S3. Το Σχήμα 5 δείχνει δύο αλληλουχίες εικόνων που επιλέχθηκαν από την ταινία M5 που δείχνουν ότι ένα βακτήριο παρουσιάζει κατευθυντική κίνηση ενώ όλα τα άλλα βακτήρια παραμένουν ακίνητα.
Τα δύο χρονικά πλαίσια (α) και (β) δείχνουν την κολύμβηση δύο διαφορετικών βακτηρίων που σημειώνονται με διακεκομμένους κύκλους. Οι εικόνες εξήχθησαν από την ταινία M5 (παρέχεται ως συμπληρωματικό υλικό).
Στην περίπτωση του G. stearothermophilus, η ενεργή κίνηση των βακτηρίων (Εικ. 5) ξεκίνησε λίγα δευτερόλεπτα μετά την ενεργοποίηση της δέσμης λέιζερ. Αυτή η παρατήρηση τονίζει τη χρονική απόκριση αυτού του θερμόφιλου μικροοργανισμού σε μια αύξηση της θερμοκρασίας, όπως έχει ήδη παρατηρηθεί από τους Mora et al. 24 . Το θέμα της βακτηριακής κινητικότητας και ακόμη και της θερμοταξίας μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω χρησιμοποιώντας το LA-HTM.
Η μικροβιακή κολύμβηση δεν πρέπει να συγχέεται με άλλους τύπους φυσικής κίνησης, συγκεκριμένα (i) κίνηση Brown, η οποία φαίνεται να είναι χαοτική κίνηση χωρίς καθορισμένη κατεύθυνση, (ii) μεταφορά 50 και θερμοφόρηση 43, που συνίσταται σε μια κανονική μετατόπιση της κίνησης κατά μήκος μιας θερμοκρασίας κλίση.
Το G. stearothermophilus είναι γνωστό για την ικανότητά του να παράγει εξαιρετικά ανθεκτικά σπόρια (σχηματισμός σπορίων) όταν εκτίθεται σε δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες ως άμυνα. Όταν οι περιβαλλοντικές συνθήκες γίνονται και πάλι ευνοϊκές, τα σπόρια βλασταίνουν, σχηματίζοντας ζωντανά κύτταρα και ξαναρχίζοντας την ανάπτυξη. Αν και αυτή η διαδικασία σπορίωσης/βλάστησης είναι γνωστή, δεν έχει παρατηρηθεί ποτέ σε πραγματικό χρόνο. Χρησιμοποιώντας το LA-HTM, αναφέρουμε εδώ την πρώτη παρατήρηση γεγονότων βλάστησης στο G. stearothermophilus.
Στο σχ. Το Σχήμα 6α δείχνει εικόνες time-lapse οπτικού βάθους (OT) που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας ένα σύνολο CGM 13 σπορίων. Για ολόκληρο το χρόνο συλλογής (15 ώρες 6 λεπτά, \(t=0\) – η αρχή της θέρμανσης με λέιζερ), 4 από τα 13 σπόρια φύτρωσαν, σε διαδοχικά χρονικά σημεία \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' και \(11\) h \(30\)'. Αν και μόνο ένα από αυτά τα συμβάντα φαίνεται στο Σχήμα 6, 4 συμβάντα βλάστησης μπορούν να παρατηρηθούν στην ταινία M6 στο συμπληρωματικό υλικό. Είναι ενδιαφέρον ότι η βλάστηση φαίνεται να είναι τυχαία: δεν βλασταίνουν όλα τα σπόρια και δεν βλασταίνουν ταυτόχρονα, παρά τις ίδιες αλλαγές στις περιβαλλοντικές συνθήκες.
ένα Time-lapse που αποτελείται από 8 εικόνες OT (βύθιση λαδιού, 60x, αντικειμενικός στόχος 1,25 NA) και (β) εξέλιξη βιομάζας αδρανών G. stearothermophilus. γ (β) Σχεδιασμένο σε ημι-λογαριθμική κλίμακα για να τονιστεί η γραμμικότητα του ρυθμού ανάπτυξης (διακεκομμένη γραμμή).
Στο σχ. Το Σχήμα 6b,c δείχνει τη βιομάζα των κυτταρικών πληθυσμών στο οπτικό πεδίο ως συνάρτηση του χρόνου για ολόκληρη την περίοδο συλλογής δεδομένων. Η γρήγορη διάσπαση της ξηρής μάζας που παρατηρείται στις \(t=5\)h στο σχ. 6β, γ, λόγω της εξόδου ορισμένων κελιών από το οπτικό πεδίο. Ο ρυθμός ανάπτυξης αυτών των τεσσάρων γεγονότων είναι \(0,77\pm 0,1\) h-1. Αυτή η τιμή είναι υψηλότερη από τον ρυθμό ανάπτυξης που σχετίζεται με το Σχήμα 3. 3 και 4, όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται κανονικά. Ο λόγος για τον αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης του G. stearothermophilus από τα σπόρια δεν είναι σαφής, αλλά αυτές οι μετρήσεις υπογραμμίζουν το ενδιαφέρον του LA-HTM και εργάζονται σε επίπεδο μεμονωμένου κυττάρου (ή σε επίπεδο μεμονωμένου mCFU) για να μάθουν περισσότερα για τη δυναμική της κυτταρικής ζωής .
Για να δείξουμε περαιτέρω την ευελιξία του LA-HTM και την απόδοσή του σε υψηλές θερμοκρασίες, εξετάσαμε την ανάπτυξη του Sulfolobus shibatae, μιας υπερθερμοφιλικής οξεόφιλης αρχαίας με βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης 80°C51. Σε σύγκριση με το G. stearothermophilus, αυτά τα αρχαία έχουν επίσης πολύ διαφορετική μορφολογία, που μοιάζουν με σφαίρες 1 μικρού (κόκκοι) παρά με επιμήκεις ράβδους (βάκιλλους).
Το Σχήμα 7α αποτελείται από διαδοχικές εικόνες οπτικού βάθους του S. shibatae mCFU που ελήφθησαν με χρήση CGM (βλ. φιλμ μεγάλου μήκους Μ7 στα Συμπληρωματικά Υλικά). Αυτό το mCFU αναπτύσσεται περίπου στους 73°C, κάτω από τη βέλτιστη θερμοκρασία των 80°C, αλλά εντός του εύρους θερμοκρασίας για ενεργό ανάπτυξη. Παρατηρήσαμε πολλαπλά συμβάντα σχάσης που έκαναν τα mCFU να μοιάζουν με μικροσταφύλια αρχαίων μετά από λίγες ώρες. Από αυτές τις εικόνες OT, η βιομάζα mCFU μετρήθηκε με την πάροδο του χρόνου και παρουσιάστηκε στο Σχήμα 7β. Είναι ενδιαφέρον ότι τα mCFU του S. shibatae εμφάνισαν γραμμική ανάπτυξη παρά την εκθετική ανάπτυξη που παρατηρήθηκε με τα mCFUs του G. stearothermophilus. Υπάρχει μια μακροχρόνια συζήτηση 52 σχετικά με τη φύση των ρυθμών ανάπτυξης των κυττάρων: ενώ ορισμένες μελέτες αναφέρουν ρυθμούς ανάπτυξης μικροβίων που είναι ανάλογοι με το μέγεθός τους (εκθετική ανάπτυξη), άλλες δείχνουν σταθερό ρυθμό (γραμμική ή διγραμμική ανάπτυξη). Όπως εξηγείται από τους Tzur et al.53, η διάκριση μεταξύ εκθετικής και (δι)γραμμικής ανάπτυξης απαιτεί ακρίβεια <6% στις μετρήσεις βιομάζας, η οποία είναι απρόσιτη για τις περισσότερες τεχνικές QPM, ακόμη και που περιλαμβάνουν συμβολομετρία. Όπως εξηγείται από τους Tzur et al.53, η διάκριση μεταξύ εκθετικής και (δι)γραμμικής ανάπτυξης απαιτεί ακρίβεια <6% στις μετρήσεις βιομάζας, η οποία είναι απρόσιτη για τις περισσότερες τεχνικές QPM, ακόμη και που περιλαμβάνουν συμβολομετρία. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста ζητάει ακρίβεια <6% σε ισομερή βιομάζα, δηλαδή ανεπαρκές για πολύ καλές μεθόδους QPM, να γίνεται με χρήση των εσωτερικών μετρήσεων. Όπως εξηγείται από τους Zur et al.53, η διάκριση μεταξύ εκθετικής και (δι)γραμμικής ανάπτυξης απαιτεί ακρίβεια <6% στις μετρήσεις βιομάζας, κάτι που είναι ανέφικτο για τις περισσότερες μεθόδους QPM, ακόμη και με τη χρήση συμβολομετρίας.Όπως εξηγείται από τους Zur et al. 53, η διάκριση μεταξύ εκθετικής και (δι)γραμμικής ανάπτυξης απαιτεί ακρίβεια μικρότερη από 6% στις μετρήσεις βιομάζας, κάτι που είναι ανέφικτο για τις περισσότερες μεθόδους QPM, ακόμη και όταν χρησιμοποιείται συμβολομετρία. Το CGM επιτυγχάνει αυτήν την ακρίβεια με ακρίβεια υποσελίδων στις μετρήσεις βιομάζας36,48.
ένα Time-lapse που αποτελείται από 6 εικόνες OT (βύθιση λαδιού, 60x, στόχος NA 1.25) και (β) η εξέλιξη βιομάζας micro-CFU που μετρήθηκε με CGM. Δείτε την ταινία M7 για περισσότερες πληροφορίες.
Η τέλεια γραμμική ανάπτυξη του S. shibatae ήταν απροσδόκητη και δεν έχει ακόμη αναφερθεί. Ωστόσο, αναμένεται εκθετική ανάπτυξη, τουλάχιστον επειδή με την πάροδο του χρόνου, πρέπει να συμβούν πολλαπλές διαιρέσεις 2, 4, 8, 16 … κυττάρων. Υποθέσαμε ότι η γραμμική ανάπτυξη μπορεί να οφείλεται σε κυτταρική αναστολή λόγω της πυκνής κυτταρικής συσσώρευσης, ακριβώς όπως η κυτταρική ανάπτυξη επιβραδύνεται και τελικά φτάνει σε κατάσταση αδράνειας όταν η κυτταρική πυκνότητα είναι πολύ υψηλή.
Ολοκληρώνουμε συζητώντας τα ακόλουθα πέντε σημεία ενδιαφέροντος με τη σειρά: μείωση του όγκου θέρμανσης, μείωση της θερμικής αδράνειας, ενδιαφέρον για νανοσωματίδια χρυσού, ενδιαφέρον για ποσοτική μικροσκοπία φάσης και ένα πιθανό εύρος θερμοκρασίας στο οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί το LA-HTM.
Σε σύγκριση με τη θέρμανση με αντίσταση, η θέρμανση με λέιζερ που χρησιμοποιείται για την ανάπτυξη HTM προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα, τα οποία επεξηγούμε σε αυτή τη μελέτη. Ειδικότερα, σε υγρά μέσα στο οπτικό πεδίο του μικροσκοπίου, ο όγκος θέρμανσης διατηρείται εντός μερικών (10 μm) 3 όγκων. Με αυτόν τον τρόπο, μόνο τα παρατηρούμενα μικρόβια είναι ενεργά, ενώ άλλα βακτήρια είναι σε αδράνεια και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω μελέτη του δείγματος – δεν χρειάζεται να αλλάζετε το δείγμα κάθε φορά που χρειάζεται να ελέγχεται μια νέα θερμοκρασία. Επιπλέον, η θέρμανση σε μικροκλίμακα επιτρέπει την άμεση εξέταση μεγάλου εύρους θερμοκρασιών: Το Σχήμα 4c λήφθηκε από μια ταινία 3 ωρών (Ταινία M3), η οποία συνήθως απαιτεί την προετοιμασία και την εξέταση πολλών δειγμάτων – ένα για καθένα από τα υπό μελέτη δείγματα. y είναι η θερμοκρασία που αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ημερών στο πείραμα. Η μείωση του θερμαινόμενου όγκου διατηρεί επίσης όλα τα γύρω οπτικά εξαρτήματα του μικροσκοπίου, ειδικά τον αντικειμενικό φακό, σε θερμοκρασία δωματίου, κάτι που ήταν ένα σημαντικό πρόβλημα που αντιμετωπίζει η κοινότητα μέχρι στιγμής. Το LA-HTM μπορεί να χρησιμοποιηθεί με οποιονδήποτε φακό, συμπεριλαμβανομένων των φακών εμβάπτισης λαδιού, και θα παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου ακόμα και με ακραίες θερμοκρασίες στο οπτικό πεδίο. Ο κύριος περιορισμός της μεθόδου θέρμανσης με λέιζερ που αναφέρουμε σε αυτή τη μελέτη είναι ότι τα κύτταρα που δεν προσκολλώνται ή επιπλέουν μπορεί να είναι μακριά από το οπτικό πεδίο και δύσκολο να μελετηθούν. Μια λύση θα μπορούσε να είναι η χρήση φακών χαμηλής μεγέθυνσης για την επίτευξη μεγαλύτερης αύξησης θερμοκρασίας άνω των μερικών εκατοντάδων μικρών. Αυτή η προσοχή συνοδεύεται από μείωση της χωρικής ανάλυσης, αλλά εάν ο στόχος είναι η μελέτη της κίνησης των μικροοργανισμών, δεν απαιτείται υψηλή χωρική ανάλυση.
Η χρονική κλίμακα για τη θέρμανση (και την ψύξη) του συστήματος \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) εξαρτάται από το μέγεθός του , σύμφωνα με το νόμο \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), όπου \ (L\ ) είναι το χαρακτηριστικό μέγεθος της πηγής θερμότητας (η διάμετρος της δέσμης λέιζερ στη μελέτη μας είναι \(L\ περίπου 100\) μm), \(D\) είναι η θερμική διαχυτικότητα του περιβάλλοντος (μέση θήκη, γυαλί και νερό Ταχύτητα διάχυσης\(D\ περίπου 2\πλάσιο {10}^{-7}\) m2/s Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, χρονικές αποκρίσεις της τάξης των 50 ms, δηλαδή σχεδόν στιγμιαίες). αλλαγές θερμοκρασίας, μπορούν να αναμένονται Αυτή η στιγμιαία καθιέρωση της αύξησης της θερμοκρασίας όχι μόνο συντομεύει τη διάρκεια του πειράματος, αλλά επιτρέπει επίσης ακριβή χρονισμό \(t=0\) για οποιαδήποτε δυναμική μελέτη των επιδράσεων της θερμοκρασίας.
Η προτεινόμενη μέθοδος μας είναι εφαρμόσιμη σε οποιοδήποτε υπόστρωμα που απορροφά το φως (για παράδειγμα, εμπορικά δείγματα με επίστρωση ITO). Ωστόσο, τα νανοσωματίδια χρυσού είναι σε θέση να παρέχουν υψηλή απορρόφηση στο υπέρυθρο και χαμηλή απορρόφηση στην ορατή περιοχή, τα τελευταία χαρακτηριστικά των οποίων ενδιαφέρουν για αποτελεσματική οπτική παρατήρηση στο ορατό εύρος, ειδικά όταν χρησιμοποιείται φθορισμός. Επιπλέον, ο χρυσός είναι βιοσυμβατός, χημικά αδρανής, η οπτική πυκνότητα μπορεί να ρυθμιστεί από 530 nm σε σχεδόν υπέρυθρες και η προετοιμασία του δείγματος είναι απλή και οικονομική29.
Το εγκάρσιο πλέγμα μετώπου κύματος μικροσκοπία (CGM) επιτρέπει όχι μόνο τη χαρτογράφηση θερμοκρασίας σε μικροκλίμακα, αλλά και την παρακολούθηση της βιομάζας, καθιστώντας το ιδιαίτερα χρήσιμο (αν δεν είναι απαραίτητο) σε συνδυασμό με το LA-HTM. Κατά την τελευταία δεκαετία, έχουν αναπτυχθεί άλλες τεχνικές μικροσκοπίας θερμοκρασίας, ειδικά στον τομέα της βιοαπεικονιστικής απεικόνισης, και οι περισσότερες από αυτές απαιτούν τη χρήση ευαίσθητων στη θερμοκρασία ανιχνευτών φθορισμού54,55. Ωστόσο, αυτές οι μέθοδοι έχουν επικριθεί και ορισμένες αναφορές έχουν μετρήσει μη ρεαλιστικές αλλαγές θερμοκρασίας μέσα στα κύτταρα, πιθανώς λόγω του γεγονότος ότι ο φθορισμός εξαρτάται από πολλούς παράγοντες εκτός από τη θερμοκρασία. Επιπλέον, οι περισσότεροι ανιχνευτές φθορισμού είναι ασταθείς σε υψηλές θερμοκρασίες. Επομένως, το QPM και ειδικότερα το CGM αντιπροσωπεύουν μια ιδανική τεχνική μικροσκοπίας θερμοκρασίας για τη μελέτη της ζωής σε υψηλές θερμοκρασίες χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο.
Μελέτες του S. shibatae, που ζουν βέλτιστα στους 80°C, δείχνουν ότι το LA-HTM μπορεί να εφαρμοστεί για τη μελέτη υπερθερμόφιλων, όχι μόνο απλών θερμόφιλων. Κατ 'αρχήν, δεν υπάρχει όριο στο εύρος θερμοκρασιών που μπορεί να επιτευχθεί χρησιμοποιώντας το LA-HTM, και ακόμη και θερμοκρασίες πάνω από 100°C μπορούν να επιτευχθούν σε ατμοσφαιρική πίεση χωρίς βρασμό, όπως αποδεικνύεται από την ομάδα μας των 38 σε εφαρμογές υδροθερμικής χημείας στην ατμοσφαιρική πίεση Α. Χρησιμοποιείται λέιζερ για τη θέρμανση νανοσωματιδίων χρυσού 40 με τον ίδιο τρόπο. Έτσι, το LA-HTM έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί για την παρατήρηση πρωτοφανών υπερθερμοφίλων με τυπικό οπτικό μικροσκόπιο υψηλής ανάλυσης υπό τυπικές συνθήκες (δηλ. υπό περιβαλλοντική καταπόνηση).
Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας σπιτικό μικροσκόπιο, συμπεριλαμβανομένου φωτισμού Köhler (με LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), υποδοχή δείγματος με χειροκίνητη κίνηση xy, αντικειμενικούς σκοπούς (Olympus, 60x, 0,7 NA, αέρα, LUCPlanFLN60X ή 625x, NA1. , UPLFLN60XOI), κάμερα CGM (διασταυρούμενη σχάρα QLSI, βήμα 39 μm, 0,87 mm από τον αισθητήρα κάμερας Andor Zyla) για παροχή απεικόνισης έντασης και κυματομετώπου και κάμερα sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, λειτουργία 16 bit , από Hamamatsu) για την εγγραφή δεδομένα που φαίνονται στο Σχήμα 5 (βακτηριακή κολύμβηση). Ο διαχωριστής διχρωμίας δέσμης είναι μια άκρη BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Το φίλτρο στο μπροστινό μέρος της κάμερας είναι ένα βραχυπερατό φίλτρο 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Λέιζερ ζαφείρι τιτανίου (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, αντλούμενη κοιλότητα λέιζερ τσουνάμι, Spectra-Physics στο Σχ. 2-5, αντικαταστάθηκε περαιτέρω από το λέιζερ Millenia, Spectraphysics 10 W, αντλούμενη κοιλότητα λέιζερ Mira, Συνεκτική2, για . -5). 6 και 7) ορίζονται στο μήκος κύματος \({{{({\rm{\λάμδα }}}}}}=800\) nm, που αντιστοιχεί στο φάσμα συντονισμού πλασμονίου των νανοσωματιδίων χρυσού. Διαμορφωτές του χώρου (1920 × 1152 εικονοστοιχεία) αγοράστηκαν από την Meadowlark Optics. Τα ολογράμματα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Gerchberg-Saxton, όπως περιγράφεται στον σύνδεσμο 39.
Το cross grating wavefront microscopy (CGM) είναι μια τεχνική οπτικής μικροσκοπίας που βασίζεται στο συνδυασμό ενός δισδιάστατου πλέγματος περίθλασης (γνωστό και ως cross grating) σε απόσταση ενός χιλιοστού από τον αισθητήρα μιας συμβατικής κάμερας. Το πιο συνηθισμένο παράδειγμα ενός CGM που χρησιμοποιήσαμε σε αυτή τη μελέτη ονομάζεται συμβολόμετρο εγκάρσιας μετατόπισης τεσσάρων μήκους κύματος (QLSI), όπου η εγκάρσια σχάρα αποτελείται από ένα μοτίβο σκακιέρας έντασης/φάσης που εισήχθη και κατοχυρώθηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας από τους Primot et al. το 200034. Οι κάθετες και οριζόντιες γραμμές πλέγματος δημιουργούν σκιές σαν πλέγμα στον αισθητήρα, η παραμόρφωση των οποίων μπορεί να υποβληθεί σε αριθμητική επεξεργασία σε πραγματικό χρόνο για να ληφθεί η παραμόρφωση οπτικού μετώπου κύματος (ή ισοδύναμο προφίλ φάσης) του προσπίπτοντος φωτός. Όταν χρησιμοποιείται σε μικροσκόπιο, μια κάμερα CGM μπορεί να εμφανίσει τη διαφορά οπτικής διαδρομής ενός αντικειμένου που απεικονίζεται, γνωστό και ως οπτικό βάθος (OT), με ευαισθησία της τάξης των νανομέτρων36. Σε οποιαδήποτε μέτρηση CGM, προκειμένου να εξαλειφθούν τυχόν ελαττώματα στα οπτικά εξαρτήματα ή τις δέσμες, πρέπει να ληφθεί μια κύρια εικόνα OT αναφοράς και να αφαιρεθεί από τυχόν επόμενες εικόνες.
Πραγματοποιήθηκε μικροσκοπία θερμοκρασίας χρησιμοποιώντας κάμερα CGM όπως περιγράφεται στην αναφορά. 32. Εν ολίγοις, η θέρμανση ενός υγρού αλλάζει τον δείκτη διάθλασής του, δημιουργώντας ένα φαινόμενο θερμικού φακού που παραμορφώνει την προσπίπτουσα δέσμη. Αυτή η παραμόρφωση μετώπου κύματος μετράται από το CGM και υποβάλλεται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας έναν αλγόριθμο αποσυνέλιξης για να ληφθεί μια τρισδιάστατη κατανομή θερμοκρασίας στο υγρό μέσο. Εάν τα νανοσωματίδια χρυσού είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα σε όλο το δείγμα, η χαρτογράφηση θερμοκρασίας μπορεί να γίνει σε περιοχές χωρίς βακτήρια για να παραχθούν καλύτερες εικόνες, κάτι που κάνουμε μερικές φορές. Η εικόνα αναφοράς CGM λήφθηκε χωρίς θέρμανση (με το λέιζερ απενεργοποιημένο) και στη συνέχεια καταγράφηκε στην ίδια θέση στην εικόνα με το λέιζερ ενεργοποιημένο.
Η μέτρηση ξηρής μάζας επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας την ίδια κάμερα CGM που χρησιμοποιείται για την απεικόνιση θερμοκρασίας. Οι εικόνες αναφοράς CGM λήφθηκαν με ταχεία μετακίνηση του δείγματος σε x και y κατά την έκθεση ως μέσο υπολογισμού του μέσου όρου τυχόν ανομοιογένειας στο OT λόγω της παρουσίας βακτηρίων. Από εικόνες OT βακτηρίων, η βιομάζα τους ελήφθη χρησιμοποιώντας ένα σύνολο εικόνων σε περιοχές που επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τον αυτοσχέδιο αλγόριθμο τμηματοποίησης της Matlab (βλ. υποενότητα «Αριθμητικός κώδικας»), ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφεται στην αναφ. 48. Εν συντομία, χρησιμοποιούμε τη σχέση \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), όπου \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) είναι η εικόνα οπτικού βάθους, \(m\) είναι το ξηρό βάρος και \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) είναι μια σταθερά. Επιλέξαμε \({{{\rm{\άλφα))))))=0,18\) μm3/pg, που είναι μια τυπική σταθερά για ζωντανά κύτταρα.
Μια ολίσθηση κάλυψης διαμέτρου 25 mm και πάχους 150 μm επικαλυμμένη με νανοσωματίδια χρυσού τοποθετήθηκε σε θάλαμο AttofluorTM (Thermofisher) με τα νανοσωματίδια χρυσού στραμμένα προς τα επάνω. Ο Geobacillus stearothermophilus προκαλλιεργήθηκε όλη τη νύχτα σε μέσο LB (200 rpm, 60°C) πριν από κάθε ημέρα πειραμάτων. Μια σταγόνα 5 μl ενός εναιωρήματος G. stearothermophilus με οπτική πυκνότητα (OD) από 0,3 έως 0,5 τοποθετήθηκε σε μια πλάκα κάλυψης με νανοσωματίδια χρυσού. Στη συνέχεια, μια στρογγυλή καλυπτρίδα διαμέτρου 18 mm με οπή διαμέτρου 5 mm στο κέντρο έπεσε πάνω στη σταγόνα και 5 μl βακτηριακού εναιωρήματος με την ίδια οπτική πυκνότητα εφαρμόστηκαν επανειλημμένα στο κέντρο της οπής. Τα φρεάτια στις καλυπτρίδες παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στην αναφ. 45 (βλ. Συμπληρωματικές πληροφορίες για περισσότερες πληροφορίες). Στη συνέχεια, προσθέστε 1 ml μέσου LB στην καλυπτρίδα για να αποτρέψετε το στέγνωμα του υγρού στρώματος. Η τελευταία καλυπτρίδα τοποθετείται πάνω από το κλειστό καπάκι του θαλάμου Attofluor™ για να αποτραπεί η εξάτμιση του μέσου κατά την επώαση. Για πειράματα βλάστησης χρησιμοποιήσαμε σπόρια, τα οποία, μετά από συμβατικά πειράματα, μερικές φορές κάλυπταν το άνω καλυπτρίδιο. Μια παρόμοια μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη Sulfolobus shibatae. Τρεις ημέρες (200 rpm, 75°C) προκαταρκτικής καλλιέργειας του Thiobacillus serrata διεξήχθησαν σε μέσο 182 (DSMZ).
Δείγματα νανοσωματιδίων χρυσού παρασκευάστηκαν με μικκυλιακή λιθογραφία συμπολυμερούς μπλοκ. Αυτή η διαδικασία περιγράφεται λεπτομερώς στο Κεφ. 60. Εν συντομία, μικκύλια που ενθυλακώνουν ιόντα χρυσού συντέθηκαν με ανάμιξη του συμπολυμερούς με HAuCl4 σε τολουόλιο. Οι καθαρισμένες καλυπτρίδες στη συνέχεια βυθίστηκαν στο διάλυμα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ακτινοβολία UV παρουσία ενός αναγωγικού παράγοντα για να ληφθούν σπόροι χρυσού. Τέλος, σπόροι χρυσού αναπτύχθηκαν με επαφή μιας καλυπτρίδας με ένα υδατικό διάλυμα KAuCl4 και αιθανολαμίνης για 16 λεπτά, γεγονός που είχε ως αποτέλεσμα μια σχεδόν περιοδική και πολύ ομοιόμορφη διάταξη μη σφαιρικών νανοσωματιδίων χρυσού στο εγγύς υπέρυθρο.
Για να μετατρέψουμε τα παρεμβολογράμματα σε εικόνες OT, χρησιμοποιήσαμε έναν αυτοσχέδιο αλγόριθμο, όπως περιγράφεται αναλυτικά στον σύνδεσμο. 33 και είναι διαθέσιμο ως πακέτο Matlab στο ακόλουθο δημόσιο αποθετήριο: https://github.com/baffou/CGMprocess. Το πακέτο μπορεί να υπολογίσει την ένταση και τις εικόνες OT με βάση τα εγγεγραμμένα παρεμβολογράμματα (συμπεριλαμβανομένων των εικόνων αναφοράς) και τις αποστάσεις συστοιχίας κάμερας.
Για να υπολογίσουμε το μοτίβο φάσης που εφαρμόζεται στο SLM για να αποκτήσουμε ένα δεδομένο προφίλ θερμοκρασίας, χρησιμοποιήσαμε έναν προηγουμένως αναπτυγμένο αλγόριθμο οικιακής χρήσης39,42 ο οποίος είναι διαθέσιμος στο ακόλουθο δημόσιο αποθετήριο: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Η είσοδος είναι το επιθυμητό πεδίο θερμοκρασίας, το οποίο μπορεί να ρυθμιστεί ψηφιακά ή μέσω μιας μονόχρωμης εικόνας bmp.
Για να τμηματοποιήσουμε τα κύτταρα και να μετρήσουμε το ξηρό βάρος τους, χρησιμοποιήσαμε τον αλγόριθμό μας Matlab που δημοσιεύτηκε στο ακόλουθο δημόσιο αποθετήριο: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Σε κάθε εικόνα, ο χρήστης πρέπει να κάνει κλικ στα βακτήρια ή στο mCFU που ενδιαφέρει, να προσαρμόσει την ευαισθησία του ραβδιού και να επιβεβαιώσει την επιλογή.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το σχεδιασμό της μελέτης, ανατρέξτε στην περίληψη της Έκθεσης Έρευνας Φύσης που συνδέεται με αυτό το άρθρο.
Δεδομένα που υποστηρίζουν τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης είναι διαθέσιμα από τους αντίστοιχους συγγραφείς κατόπιν εύλογου αιτήματος.
Ο πηγαίος κώδικας που χρησιμοποιείται σε αυτήν τη μελέτη περιγράφεται λεπτομερώς στην ενότητα Μέθοδοι και οι εκδόσεις εντοπισμού σφαλμάτων μπορούν να ληφθούν από τη διεύθυνση https://github.com/baffou/ στα ακόλουθα αποθετήρια: SLM_temperatureShaping, CGMprocess και CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight για τα θερμόφιλα και τις εφαρμογές ευρέος φάσματος τους. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight για τα θερμόφιλα και τις εφαρμογές ευρέος φάσματος τους.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. and Sharma, AK Επισκόπηση των θερμόφιλων και η ευρεία εφαρμογή τους. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, Ρ., Singh, Η., Damle, D. & Sharma, ΑΚ.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. and Sharma AK Μια βαθιά κατανόηση των θερμόφιλων και ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-26-2022