Η νόσος Alzheimer (AD) στερείται πρωτεϊνικών βιοδεικτών που αντικατοπτρίζουν την πολλαπλή υποκείμενη παθοφυσιολογία της, εμποδίζοντας την πρόοδο της διάγνωσης και της θεραπείας. Εδώ, χρησιμοποιούμε ολοκληρωμένη πρωτεομική για τον εντοπισμό βιοδεικτών εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ) που αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ φάσμα παθοφυσιολογίας της AD. Η πολλαπλή φασματομετρία μάζας εντόπισε περίπου 3.500 και περίπου 12.000 πρωτεΐνες στο AD CSF και στον εγκέφαλο, αντίστοιχα. Η ανάλυση δικτύου του πρωτεώματος του εγκεφάλου επέλυσε 44 ενότητες βιοποικιλότητας, 15 από τις οποίες αλληλεπικαλύπτονταν με το πρωτεώμα του εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Οι δείκτες AD CSF σε αυτές τις επικαλυπτόμενες μονάδες διπλώνονται σε πέντε πρωτεϊνικές ομάδες, που αντιπροσωπεύουν διαφορετικές παθοφυσιολογικές διεργασίες. Οι συνάψεις και οι μεταβολίτες στον εγκέφαλο AD μειώνονται, αλλά το ΕΝΥ αυξάνεται, ενώ η πλούσια σε γλοία μυελίνωση και οι ανοσοποιητικές ομάδες στον εγκέφαλο και στο ΕΝΥ αυξάνονται. Η συνέπεια και η ειδικότητα της νόσου των αλλαγών του πάνελ επιβεβαιώθηκαν σε περισσότερα από 500 επιπλέον δείγματα ΕΝΥ. Αυτές οι ομάδες αναγνώρισαν επίσης βιολογικές υποομάδες σε ασυμπτωματική ΝΑ. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα είναι ένα πολλά υποσχόμενο βήμα προς εργαλεία βιοδεικτών που βασίζονται στο διαδίκτυο για κλινικές εφαρμογές στην AD.
Η νόσος Alzheimer (AD) είναι η πιο κοινή αιτία νευροεκφυλιστικής άνοιας παγκοσμίως και χαρακτηρίζεται από ένα ευρύ φάσμα δυσλειτουργιών του βιολογικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένης της συναπτικής μετάδοσης, της γλοιακής ανοσίας και του μιτοχονδριακού μεταβολισμού (1-3). Ωστόσο, οι καθιερωμένοι πρωτεϊνικοί βιοδείκτες του εξακολουθούν να επικεντρώνονται στην ανίχνευση της πρωτεΐνης αμυλοειδούς και tau, και επομένως δεν μπορούν να αντικατοπτρίζουν αυτήν την ποικιλόμορφη παθοφυσιολογία. Αυτοί οι βιοδείκτες πρωτεΐνης «πυρήνα» που μετρώνται πιο αξιόπιστα στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) περιλαμβάνουν (i) το αμυλοειδές βήτα πεπτίδιο 1-42 (Αβ1-42), το οποίο αντανακλά το σχηματισμό πλακών αμυλοειδούς φλοιού. (ii) ολική ταυ, ένδειξη εκφυλισμού άξονα. (iii) phospho-tau (p-tau), ένας εκπρόσωπος της παθολογικής υπερφωσφορυλίωσης tau (4-7). Αν και αυτοί οι βιοδείκτες του εγκεφαλονωτιαίου υγρού έχουν διευκολύνει σημαντικά την ανίχνευση των «σημασμένων» ασθενειών της πρωτεΐνης AD (4-7), αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό μέρος της σύνθετης βιολογίας πίσω από τη νόσο.
Η έλλειψη παθοφυσιολογικής ποικιλομορφίας των βιοδεικτών AD έχει οδηγήσει σε πολλές προκλήσεις, συμπεριλαμβανομένης (i) της αδυναμίας εντοπισμού και ποσοτικοποίησης της βιολογικής ετερογένειας των ασθενών με AD, (ii) της ανεπαρκούς μέτρησης της σοβαρότητας και της εξέλιξης της νόσου, ειδικά στο προκλινικό στάδιο. iii) η ανάπτυξη θεραπευτικών φαρμάκων που απέτυχαν να λύσουν πλήρως όλες τις πτυχές της νευρολογικής επιδείνωσης. Η εξάρτησή μας από την παθολογία ορόσημο για την περιγραφή της ΝΑ από σχετικές ασθένειες επιδεινώνει μόνο αυτά τα προβλήματα. Όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι οι περισσότεροι ηλικιωμένοι με άνοια έχουν περισσότερα από ένα παθολογικά χαρακτηριστικά γνωστικής έκπτωσης (8). Έως και το 90% ή περισσότερο των ατόμων με παθολογία AD έχουν επίσης αγγειακή νόσο, εγκλείσματα TDP-43 ή άλλες εκφυλιστικές ασθένειες (9). Αυτά τα υψηλά ποσοστά παθολογικής επικάλυψης έχουν διαταράξει το τρέχον διαγνωστικό μας πλαίσιο για την άνοια και απαιτείται ένας πιο ολοκληρωμένος παθοφυσιολογικός ορισμός της νόσου.
Λόγω της επείγουσας ανάγκης για μια ποικιλία βιοδεικτών AD, το πεδίο υιοθετεί ολοένα και περισσότερο τη μέθοδο "omics" που βασίζεται στο συνολικό σύστημα για την ανακάλυψη βιοδεικτών. Η Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance ξεκίνησε το 2014 και βρίσκεται στην πρώτη γραμμή του προγράμματος. Αυτή η διεπιστημονική προσπάθεια από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, τον ακαδημαϊκό κόσμο και τη βιομηχανία στοχεύει στη χρήση στρατηγικών που βασίζονται σε συστήματα για τον καλύτερο προσδιορισμό της παθοφυσιολογίας της AD και την ανάπτυξη στρατηγικών διαγνωστικής ανάλυσης και θεραπείας βιοποικιλότητας (10). Ως μέρος αυτού του έργου, η δικτυακή πρωτεομική έχει γίνει ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για την πρόοδο βιοδεικτών που βασίζονται στο σύστημα στην AD. Αυτή η αμερόληπτη προσέγγιση βάσει δεδομένων οργανώνει σύνθετα σύνολα δεδομένων πρωτεϊνικής σε ομάδες ή «ενότητες» συνεκφραζόμενων πρωτεϊνών που σχετίζονται με συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους, οργανίδια και βιολογικές λειτουργίες (11-13). Σχεδόν 12 μελέτες πρωτεϊνικής δικτύων πλούσιες σε πληροφορίες έχουν διεξαχθεί στον εγκέφαλο AD (13-23). Συνολικά, αυτές οι αναλύσεις υποδεικνύουν ότι το πρωτεϊνικό δίκτυο του εγκεφάλου AD διατηρεί μια εξαιρετικά συντηρημένη σπονδυλωτή οργάνωση σε ανεξάρτητες κοόρτες και πολλαπλές περιοχές του φλοιού. Επιπλέον, ορισμένες από αυτές τις ενότητες εμφανίζουν αναπαραγώγιμες αλλαγές στην αφθονία που σχετίζεται με την AD στα σύνολα δεδομένων, αντανακλώντας την παθοφυσιολογία πολλαπλών ασθενειών. Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ένα πολλά υποσχόμενο σημείο αγκύρωσης για την ανακάλυψη του πρωτεώματος του δικτύου του εγκεφάλου ως βιοδείκτη που βασίζεται στο σύστημα στην AD.
Προκειμένου να μετατρέψουμε το πρωτεϊνικό δίκτυο του εγκεφάλου AD σε κλινικά χρήσιμους βιοδείκτες βασισμένους στο σύστημα, συνδυάσαμε το δίκτυο που προέρχεται από τον εγκέφαλο με την πρωτεομική ανάλυση του AD CSF. Αυτή η ολοκληρωμένη προσέγγιση οδήγησε στον εντοπισμό πέντε υποσχόμενων συνόλων βιοδεικτών ΕΝΥ που σχετίζονται με ένα ευρύ φάσμα παθοφυσιολογίας βασισμένη στον εγκέφαλο, συμπεριλαμβανομένων των συνάψεων, των αιμοφόρων αγγείων, της μυελίνωσης, της φλεγμονής και της δυσλειτουργίας των μεταβολικών οδών. Επικυρώσαμε επιτυχώς αυτά τα πάνελ βιοδεικτών μέσω πολλαπλών αναλύσεων αντιγραφής, συμπεριλαμβανομένων περισσότερων από 500 δειγμάτων ΕΝΥ από διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Αυτές οι αναλύσεις επικύρωσης περιλαμβάνουν την εξέταση στόχων ομάδας στο ΕΝΥ ασθενών με ασυμπτωματική AD (AsymAD) ή την εμφάνιση ενδείξεων μη φυσιολογικής συσσώρευσης αμυλοειδούς σε ένα φυσιολογικό γνωστικό περιβάλλον. Αυτές οι αναλύσεις υπογραμμίζουν τη σημαντική βιολογική ετερογένεια στον πληθυσμό AsymAD και προσδιορίζουν δείκτες πάνελ που μπορεί να είναι σε θέση να προσδιορίσουν υποτύπους άτομα στα πιο πρώιμα στάδια της νόσου. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν ένα βασικό βήμα στην ανάπτυξη εργαλείων βιοδεικτών πρωτεΐνης που βασίζονται σε πολλαπλά συστήματα που μπορούν να λύσουν με επιτυχία πολλές από τις κλινικές προκλήσεις που αντιμετωπίζει η AD.
Ο κύριος σκοπός αυτής της μελέτης είναι να εντοπίσει νέους βιοδείκτες του εγκεφαλονωτιαίου υγρού που αντανακλούν διάφορες παθοφυσιολογίες με βάση τον εγκέφαλο που οδηγούν σε AD. Το Σχήμα S1 περιγράφει τη μεθοδολογία της έρευνάς μας, η οποία περιλαμβάνει (i) μια ολοκληρωμένη ανάλυση που καθοδηγείται από προκαταρκτικά ευρήματα του AD CSF και του δικτυακού πρωτεώματος του εγκεφάλου για τον εντοπισμό πολλαπλών βιοδεικτών της νόσου του ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο και (ii) την επακόλουθη αντιγραφή Αυτοί οι βιοδείκτες βρίσκονται σε πολλούς ανεξάρτητους εγκεφαλονωτιαίους ρευστές κοόρτες. Η έρευνα προσανατολισμένη στην ανακάλυψη ξεκίνησε με την ανάλυση της διαφορικής έκφρασης του ΕΝΥ σε 20 γνωστικά φυσιολογικά άτομα και 20 ασθενείς με AD στο Ερευνητικό Κέντρο για τη Νόσο Alzheimer Emory Goizueta (ADRC). Η διάγνωση της AD ορίζεται ως μια σημαντική γνωστική εξασθένηση παρουσία χαμηλού Aβ1-42 και αυξημένων επιπέδων ολικής tau και p-tau στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Πίνακας S1A). Ο έλεγχος (μέσος όρος MoCA, 26,7 ± 2,2) είχε φυσιολογικά επίπεδα βιοδεικτών ΕΝΥ.
Το ανθρώπινο ΕΝΥ χαρακτηρίζεται από ένα δυναμικό εύρος αφθονίας πρωτεϊνών, στο οποίο η λευκωματίνη και άλλες εξαιρετικά άφθονες πρωτεΐνες μπορούν να αποτρέψουν την ανίχνευση πρωτεϊνών που ενδιαφέρουν (24). Για να αυξήσουμε το βάθος της ανακάλυψης πρωτεΐνης, αφαιρέσαμε τις πρώτες 14 πρωτεΐνες υψηλής αφθονίας από κάθε δείγμα ΕΝΥ πριν από την ανάλυση φασματομετρίας μάζας (MS) (24). Συνολικά 39.805 πεπτίδια ταυτοποιήθηκαν με MS, τα οποία χαρτογραφήθηκαν σε 3691 πρωτεώματα σε 40 δείγματα. Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης πραγματοποιείται με επισήμανση πολλαπλής διαδοχικής ετικέτας μάζας (TMT) (18, 25). Προκειμένου να επιλυθούν τα δεδομένα που λείπουν, συμπεριλάβαμε μόνο εκείνες τις πρωτεΐνες που προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε τουλάχιστον το 50% των δειγμάτων στην επακόλουθη ανάλυση, ποσοτικοποιώντας έτσι τελικά 2875 πρωτεώματα. Λόγω της σημαντικής διαφοράς στα επίπεδα συνολικής αφθονίας πρωτεϊνών, ένα δείγμα ελέγχου θεωρήθηκε στατιστικά ακραίο (13) και δεν συμπεριλήφθηκε στην επακόλουθη ανάλυση. Οι τιμές αφθονίας των υπόλοιπων 39 δειγμάτων προσαρμόστηκαν ανάλογα με την ηλικία, το φύλο και τη συνδιακύμανση παρτίδων (13-15, 17, 18, 20, 26).
Χρησιμοποιώντας στατιστική ανάλυση t-test για την αξιολόγηση της διαφορικής έκφρασης στο σύνολο δεδομένων παλινδρόμησης, αυτή η ανάλυση εντόπισε πρωτεΐνες των οποίων τα επίπεδα αφθονίας άλλαξαν σημαντικά (P <0,05) μεταξύ των περιπτώσεων ελέγχου και AD (Πίνακας S2A). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η αφθονία συνολικά 225 πρωτεϊνών στην AD μειώθηκε σημαντικά και η αφθονία των 303 πρωτεϊνών αυξήθηκε σημαντικά. Αυτές οι διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες περιλαμβάνουν αρκετούς προηγουμένως αναγνωρισμένους δείκτες AD του εγκεφαλονωτιαίου υγρού, όπως πρωτεΐνη tau που σχετίζεται με μικροσωληνίσκους (MAPT; P = 3,52 × 10−8), νευρονήμα (NEFL, P = 6,56 × 10−3), πρωτεΐνη σχετιζόμενη με την ανάπτυξη 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Πρωτεΐνη δέσμευσης λιπαρών οξέων 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), χιτινάση 3 όπως 1 (CHI3L1, P = 4,44 × 10−6), Νευρική κοκκία (NRGN; P = 3,43 × 10−4) και αυξητικός παράγοντας νεύρων VGF (VGF, P = 4,83 × 10−3) (4-6). Ωστόσο, εντοπίσαμε επίσης άλλους πολύ σημαντικούς στόχους, όπως ο αναστολέας διάστασης GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) και η σχετιζόμενη με το SPARC αρθρωτή δέσμευση ασβεστίου 1 (SMOC1, P = 6,93 × 10-9) . Η ανάλυση γονιδιακής οντολογίας (GO) 225 σημαντικά μειωμένων πρωτεϊνών αποκάλυψε στενές συνδέσεις με διεργασίες σωματικών υγρών όπως ο μεταβολισμός των στεροειδών, η πήξη του αίματος και η ορμονική δραστηριότητα (Εικόνα 1Β και Πίνακας S2B). Αντίθετα, η σημαντικά αυξημένη πρωτεΐνη του 303 σχετίζεται στενά με τη δομή των κυττάρων και τον ενεργειακό μεταβολισμό.
(Α) Η γραφική παράσταση του ηφαιστείου δείχνει την αλλαγή αναδίπλωσης log2 (άξονας x) σε σχέση με τη στατιστική τιμή P -log10 (άξονας y) που προκύπτει από τη δοκιμή t, η οποία χρησιμοποιείται για την ανίχνευση διαφορικής έκφρασης μεταξύ του ελέγχου (CT) και του ελέγχου (CT) και Περιπτώσεις AD του πρωτεώματος του ΕΝΥ Από όλες τις πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες με σημαντικά μειωμένα επίπεδα (P <0,05) στην AD φαίνονται με μπλε χρώμα, ενώ οι πρωτεΐνες με σημαντικά αυξημένα επίπεδα στη νόσο εμφανίζονται με κόκκινο. Η επιλεγμένη πρωτεΐνη είναι επισημασμένη. (Β) Οι κορυφαίοι όροι GO που σχετίζονται με την πρωτεΐνη είναι σημαντικά μειωμένοι (μπλε) και αυξημένοι (κόκκινοι) στην AD. Εμφανίζει τους τρεις όρους GO με τις υψηλότερες βαθμολογίες z στα πεδία των βιολογικών διεργασιών, των μοριακών λειτουργιών και των κυτταρικών συστατικών. (Γ) Το MS μέτρησε το επίπεδο MAPT στο δείγμα ΕΝΥ (αριστερά) και τη συσχέτισή του με το επίπεδο tau ELISA του δείγματος (δεξιά). Εμφανίζεται ο συντελεστής συσχέτισης Pearson με τη σχετική τιμή P. Λόγω της έλλειψης δεδομένων ELISA για ένα κρούσμα AD, αυτά τα στοιχεία περιλαμβάνουν τιμές για 38 από τις 39 περιπτώσεις που αναλύθηκαν. (Δ) Εποπτευόμενη ανάλυση συστάδας (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) προσαρμοσμένο P <0,01) στον έλεγχο και AD CSF βρέθηκαν δείγματα χρησιμοποιώντας τις 65 πιο σημαντικά αλλαγμένες πρωτεΐνες στο σύνολο δεδομένων. Τυποποίηση, κανονικοποίηση.
Το πρωτεομικό επίπεδο του MAPT σχετίζεται στενά με το ανεξάρτητο μετρούμενο επίπεδο tau ELISA (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9, Εικόνα 1C), υποστηρίζοντας την εγκυρότητα της μέτρησης της MS μας. Μετά την πέψη με θρυψίνη στο επίπεδο της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς (APP), τα ειδικά για την ισομορφή πεπτίδια που χαρτογραφούνται στο C-άκρο των Αβ1-40 και Αβ1-42 δεν μπορούν να ιονιστούν αποτελεσματικά (27, 28). Επομένως, τα πεπτίδια APP που εντοπίσαμε δεν έχουν καμία σχέση με τα επίπεδα ELISA Aβ1-42. Προκειμένου να αξιολογηθεί η διαφορική έκφραση κάθε περίπτωσης, χρησιμοποιήσαμε πρωτεΐνες διαφορικής έκφρασης με P <0,0001 [false discovery rate (FDR) διορθωμένη P <0,01] για να πραγματοποιήσουμε μια εποπτευόμενη ανάλυση συστάδων των δειγμάτων (Πίνακας S2A). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Δ, αυτές οι 65 εξαιρετικά σημαντικές πρωτεΐνες μπορούν να ομαδοποιήσουν σωστά δείγματα σύμφωνα με την κατάσταση της νόσου, εκτός από μία περίπτωση AD με χαρακτηριστικά παρόμοια με τον έλεγχο. Από αυτές τις 65 πρωτεΐνες, οι 63 αυξήθηκαν στην AD, ενώ μόνο δύο (CD74 και ISLR) μειώθηκαν. Συνολικά, αυτές οι αναλύσεις του εγκεφαλονωτιαίου υγρού έχουν εντοπίσει εκατοντάδες πρωτεΐνες στην AD που μπορεί να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτες της νόσου.
Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε μια ανεξάρτητη ανάλυση δικτύου του πρωτεώματος του εγκεφάλου AD. Η κοόρτη του εγκεφάλου αυτής της ανακάλυψης περιελάμβανε ραχιαίο προμετωπιαίο φλοιό (DLPFC) από μάρτυρες (n = 10), νόσο του Πάρκινσον (PD, n = 10), μικτές AD/PD (n = 10) και AD (n = 10) περιπτώσεις. ) Δείγμα. Emery Goizueta ADRC. Τα δημογραφικά στοιχεία αυτών των 40 περιπτώσεων έχουν περιγραφεί προηγουμένως (25) και συνοψίζονται στον Πίνακα S1B. Χρησιμοποιήσαμε το TMT-MS για να αναλύσουμε αυτούς τους 40 εγκεφαλικούς ιστούς και την κοόρτη αντιγραφής 27 περιπτώσεων. Συνολικά, αυτά τα δύο σύνολα δεδομένων εγκεφάλου παρήγαγαν 227.121 μοναδικά πεπτίδια, τα οποία χαρτογραφήθηκαν σε 12.943 πρωτεώματα (25). Μόνο εκείνες οι πρωτεΐνες που προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε τουλάχιστον 50% των περιπτώσεων συμπεριλήφθηκαν σε μεταγενέστερες έρευνες. Το τελικό σύνολο δεδομένων ανακάλυψης περιέχει 8817 ποσοτικοποιημένες πρωτεΐνες. Προσαρμόστε τα επίπεδα αφθονίας πρωτεϊνών με βάση την ηλικία, το φύλο και το μεταθανάτιο διάστημα (PMI). Η ανάλυση διαφορικής έκφρασης του συνόλου δεδομένων μετά την παλινδρόμηση έδειξε ότι >2000 επίπεδα πρωτεΐνης άλλαξαν σημαντικά [P <0,05, ανάλυση διακύμανσης (ANOVA)] σε δύο ή περισσότερες κοόρτες ασθενειών. Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε μια εποπτευόμενη ανάλυση συστάδων με βάση τις διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες και P <0,0001 σε συγκρίσεις AD/μάρτυρα και/ή AD/PD (Εικόνα S2, A και B, Πίνακας S2C). Αυτές οι 165 εξαιρετικά αλλοιωμένες πρωτεΐνες απεικονίζουν ξεκάθαρα περιπτώσεις με παθολογία AD από τα δείγματα ελέγχου και PD, επιβεβαιώνοντας τις έντονες ειδικές για την AD αλλαγές σε ολόκληρο το πρωτεώμα.
Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε έναν αλγόριθμο που ονομάζεται Ανάλυση Δικτύου Συνέκφρασης Βαρυσμένων Γονιδίων (WGCNA) για να εκτελέσουμε ανάλυση δικτύου στο ανακαλυφθέν πρωτεόμιο του εγκεφάλου, το οποίο οργανώνει το σύνολο δεδομένων σε πρωτεϊνικές μονάδες με παρόμοια μοτίβα έκφρασης (11-13). Η ανάλυση αναγνώρισε 44 μονάδες (Μ) συνεκφραζόμενες πρωτεΐνες, ταξινομημένες και αριθμημένες από τη μεγαλύτερη (Μ1, η = 1821 πρωτεΐνες) στη μικρότερη (Μ44, η = 34 πρωτεΐνες) (Εικόνα 2Α και Πίνακας S2D) ). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω (13) Υπολογίστε το αντιπροσωπευτικό προφίλ έκφρασης ή χαρακτηριστική πρωτεΐνη κάθε ενότητας και συσχετίστε το με την κατάσταση της νόσου και την παθολογία της AD, δηλαδή, δημιουργήστε τη συμμαχία του Μητρώου Νόσων Alzheimer (CERAD) και του Braak Score (Εικόνα 2Β). Συνολικά, 17 ενότητες σχετίζονταν σημαντικά με τη νευροπαθολογία της AD (P <0,05). Πολλές από αυτές τις ενότητες που σχετίζονται με την ασθένεια είναι επίσης πλούσιες σε δείκτες ειδικούς για κυτταρικό τύπο (Εικόνα 2Β). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω (13), ο εμπλουτισμός κυτταρικού τύπου προσδιορίζεται με ανάλυση της επικάλυψης των μονάδων και της λίστας αναφοράς των γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό τύπο. Αυτά τα γονίδια προέρχονται από δημοσιευμένα δεδομένα σε απομονωμένους νευρώνες ποντικού, ενδοθηλιακά και νευρογλοιακά κύτταρα. Πείραμα προσδιορισμού αλληλουχίας RNA (RNA-seq) (29).
(Α) Ανακαλύψτε το WGCNA του πρωτεώματος του εγκεφάλου. (Β) Ανάλυση μεσαίας συσχέτισης διβαρών (BiCor) της αρθρωτής πρωτεΐνης υπογραφής (το πρώτο κύριο συστατικό της σπονδυλωτής έκφρασης πρωτεΐνης) με νευροπαθολογικά χαρακτηριστικά AD (επάνω), συμπεριλαμβανομένων των βαθμολογιών CERAD (πλάκα Αβ) και Braak (tau tangles). Οι εντάσεις των θετικών (κόκκινων) και αρνητικών (μπλε) συσχετίσεων φαίνονται από έναν θερμικό χάρτη δύο χρωμάτων και οι αστερίσκοι υποδεικνύουν στατιστική σημασία (P <0,05). Χρησιμοποιήστε το Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (κάτω) για να αξιολογήσετε τη συσχέτιση κυτταρικού τύπου κάθε ενότητας πρωτεΐνης. Η ένταση της κόκκινης σκίασης υποδεικνύει τον βαθμό εμπλουτισμού του κυτταρικού τύπου και ο αστερίσκος υποδεικνύει στατιστική σημασία (P <0,05). Χρησιμοποιήστε τη μέθοδο BH για να διορθώσετε την τιμή P που προέρχεται από το FET. (Γ) Ανάλυση GO αρθρωτών πρωτεϊνών. Οι πιο στενά συνδεδεμένες βιολογικές διεργασίες παρουσιάζονται για κάθε ενότητα ή σχετική ομάδα ενοτήτων. ολίγο, ολιγοδενδροκύτταρο.
Ένα σύνολο πέντε στενά σχετιζόμενων δομοστοιχείων πλούσιων σε αστροκύτταρα και μικρογλοία (Μ30, Μ29, Μ18, Μ24 και Μ5) έδειξε ισχυρή θετική συσχέτιση με τη νευροπαθολογία AD (Εικόνα 2Β). Η οντολογική ανάλυση συνδέει αυτές τις γλοιακές μονάδες με την κυτταρική ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό και ανοσία (Εικόνα 2C και Πίνακας S2E). Δύο πρόσθετες νευρογλοιακές μονάδες, η Μ8 και η Μ22, ρυθμίζονται επίσης έντονα σε ασθένειες. Το M8 σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με το μονοπάτι του υποδοχέα τύπου Toll, έναν καταρράκτη σηματοδότησης που παίζει βασικό ρόλο στην έμφυτη ανοσοαπόκριση (30). Ταυτόχρονα, το M22 συνδέεται στενά με την μετα-μεταφραστική τροποποίηση. Το M2, το οποίο είναι πλούσιο σε ολιγοδενδροκύτταρα, παρουσιάζει ισχυρή θετική συσχέτιση με την παθολογία της AD και μια οντολογική σύνδεση με τη σύνθεση νουκλεοσιδίων και την αντιγραφή του DNA, υποδηλώνοντας ενισχυμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε ασθένειες. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την ανύψωση των νευρογλοιακών μονάδων που έχουμε παρατηρήσει προηγουμένως στο πρωτέωμα του δικτύου AD (13, 17). Διαπιστώθηκε επί του παρόντος ότι πολλές γλοιακές ενότητες που σχετίζονται με την AD στο δίκτυο εμφανίζουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε περιπτώσεις ελέγχου και PD, υπογραμμίζοντας την ειδικότητα της νόσου τους που είναι αυξημένη στην AD (Εικόνα S2C).
Μόνο τέσσερις ενότητες του πρωτεώματος του δικτύου μας (M1, M3, M10 και M32) συσχετίζονται ισχυρά αρνητικά με την παθολογία της AD (P <0,05) (Εικόνα 2, B και C). Τόσο η Μ1 όσο και η Μ3 είναι πλούσια σε νευρωνικούς δείκτες. Το Μ1 σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με τα συναπτικά σήματα, ενώ το Μ3 σχετίζεται στενά με τη μιτοχονδριακή λειτουργία. Δεν υπάρχουν ενδείξεις εμπλουτισμού κυτταρικού τύπου για τα Μ10 και Μ32. Το M32 αντανακλά τη σύνδεση μεταξύ του M3 και του κυτταρικού μεταβολισμού, ενώ το M10 σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με την κυτταρική ανάπτυξη και τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων. Σε σύγκριση με την AD, και οι τέσσερις ενότητες είναι αυξημένες στον έλεγχο και την PD, δίνοντάς τους αλλαγές AD ειδικά για τη νόσο (Εικόνα S2C). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τη μειωμένη αφθονία πλούσιων σε νευρώνες δομοστοιχείων που έχουμε παρατηρήσει προηγουμένως στο AD (13, 17). Συνοπτικά, η ανάλυση δικτύου του πρωτεώματος του εγκεφάλου που ανακαλύψαμε παρήγαγε ειδικά τροποποιημένες μονάδες AD σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματά μας.
Η AD χαρακτηρίζεται από ένα πρώιμο ασυμπτωματικό στάδιο (AsymAD), στο οποίο τα άτομα εμφανίζουν συσσώρευση αμυλοειδούς χωρίς κλινική γνωστική έκπτωση (5, 31). Αυτό το ασυμπτωματικό στάδιο αντιπροσωπεύει ένα κρίσιμο παράθυρο για έγκαιρη διάγνωση και παρέμβαση. Έχουμε επιδείξει στο παρελθόν ισχυρή σπονδυλωτή διατήρηση του πρωτεώματος του δικτύου εγκεφάλου AsymAD και AD σε ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων (13, 17). Προκειμένου να διασφαλίσουμε ότι το δίκτυο εγκεφάλου που ανακαλύψαμε επί του παρόντος είναι συνεπές με αυτά τα προηγούμενα ευρήματα, αναλύσαμε τη διατήρηση 44 ενοτήτων στο αναπαραγόμενο σύνολο δεδομένων από 27 οργανισμούς DLPFC. Αυτοί οι οργανισμοί περιλαμβάνουν περιπτώσεις ελέγχου (n = 10), AsymAD (n = 8 ) και AD (n = 9). Τα δείγματα ελέγχου και AD συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση της κοόρτης του εγκεφάλου ανακάλυψης (Πίνακας S1B), ενώ οι περιπτώσεις AsymAD ήταν μοναδικές μόνο στην κοόρτη αντιγραφής. Αυτές οι περιπτώσεις AsymAD προέρχονταν επίσης από την τράπεζα εγκεφάλου Emory Goizueta ADRC. Αν και η γνωστική λειτουργία ήταν φυσιολογική τη στιγμή του θανάτου, τα επίπεδα αμυλοειδούς ήταν ασυνήθιστα υψηλά (μέση τιμή CERAD, 2,8 ± 0,5) (Πίνακας S1B).
Η ανάλυση TMT-MS αυτών των 27 εγκεφαλικών ιστών είχε ως αποτέλεσμα τον ποσοτικό προσδιορισμό 11.244 πρωτεωμάτων. Αυτή η τελική μέτρηση περιλαμβάνει μόνο εκείνες τις πρωτεΐνες που έχουν ποσοτικοποιηθεί τουλάχιστον στο 50% των δειγμάτων. Αυτό το αναπαραγόμενο σύνολο δεδομένων περιέχει 8638 (98,0%) από τις 8817 πρωτεΐνες που ανιχνεύθηκαν στην ανακαλυπτική ανάλυση του εγκεφάλου μας και έχει σχεδόν 3000 σημαντικά αλλαγμένες πρωτεΐνες μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της AD (P <0,05, μετά το ζεύγος t test Tukey για ανάλυση διακύμανσης) ( Πίνακας S2F). Μεταξύ αυτών των διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών, οι 910 εμφάνισαν επίσης σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα μεταξύ των περιπτώσεων ελέγχου AD και πρωτεώματος εγκεφάλου (P <0,05, μετά από ANOVA Tukey paired t-test). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτοί οι δείκτες 910 είναι εξαιρετικά συνεπείς στην κατεύθυνση της αλλαγής μεταξύ των πρωτεωμάτων (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Εικόνα S3A). Μεταξύ των αυξημένων πρωτεϊνών, οι πρωτεΐνες με τις πιο σταθερές αλλαγές μεταξύ των συνόλων δεδομένων είναι κυρίως μέλη των πλούσιων σε γλοία ενοτήτων M5 και M18 (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 και GFAP). Μεταξύ των μειωμένων πρωτεϊνών, εκείνες με τις πιο σταθερές αλλαγές ήταν σχεδόν αποκλειστικά μέλη της μονάδας M1 (NPTX2, VGF και RPH3A) που σχετίζεται με τη σύναψη. Επαληθεύσαμε περαιτέρω τις σχετιζόμενες με την AD αλλαγές της midkine (MDK), CD44, της εκκρινόμενης πρωτεΐνης 1 που σχετίζεται με το φριζάρισμα (SFRP1) και του VGF με στύπωμα Western (Εικόνα S3B). Η ανάλυση διατήρησης της μονάδας έδειξε ότι περίπου το 80% των πρωτεϊνικών μονάδων (34/44) στο πρωτεϊνικό εγκέφαλο διατηρήθηκαν σημαντικά στο σύνολο δεδομένων αντιγραφής (z-score> 1,96, FDR διορθώθηκε P <0,05) (Εικόνα S3C). Δεκατέσσερις από αυτές τις μονάδες δεσμεύτηκαν ειδικά μεταξύ των δύο πρωτεωμάτων (z-score> 10, FDR διορθώθηκε P <1,0 × 10−23). Συνολικά, η ανακάλυψη και η αναπαραγωγή του υψηλού βαθμού συνέπειας στη διαφορική έκφραση και τη σπονδυλωτή σύνθεση μεταξύ του πρωτεώματος του εγκεφάλου υπογραμμίζει την αναπαραγωγιμότητα των αλλαγών στις πρωτεΐνες του μετωπιαίου φλοιού της AD. Επιπλέον, επιβεβαίωσε επίσης ότι το AsymAD και οι πιο προχωρημένες ασθένειες έχουν παρόμοια δομή εγκεφάλου δικτύου.
Μια πιο λεπτομερής ανάλυση της διαφορικής έκφρασης στο σύνολο δεδομένων αντιγραφής του εγκεφάλου υπογραμμίζει τον σημαντικό βαθμό αλλαγών στην πρωτεΐνη AsymAD, συμπεριλαμβανομένων συνολικά 151 σημαντικά αλλαγμένων πρωτεϊνών μεταξύ του AsymAD και του ελέγχου (P <0,05) (Εικόνα S3D). Σε συμφωνία με το φορτίο αμυλοειδούς, η APP στον εγκέφαλο των AsymAD και AD αυξήθηκε σημαντικά. Το MAPT αλλάζει σημαντικά μόνο στην AD, κάτι που είναι σύμφωνο με τα αυξημένα επίπεδα μπερδέματος και τη γνωστή συσχέτισή του με τη γνωστική έκπτωση (5, 7). Οι πλούσιες σε γλοιακές μονάδες (M5 και M18) αντανακλώνται σε μεγάλο βαθμό στις αυξημένες πρωτεΐνες στο AsymAD, ενώ η μονάδα M1 που σχετίζεται με νευρώνες είναι η πιο αντιπροσωπευτική από τις μειωμένες πρωτεΐνες στο AsymAD. Πολλοί από αυτούς τους δείκτες AsymAD δείχνουν μεγαλύτερες αλλαγές στις συμπτωματικές ασθένειες. Μεταξύ αυτών των δεικτών είναι η SMOC1, μια γλοιακή πρωτεΐνη που ανήκει στο M18, η οποία σχετίζεται με όγκους του εγκεφάλου και την ανάπτυξη των ματιών και των άκρων (32). Το MDK είναι ένας αυξητικός παράγοντας που δεσμεύει την ηπαρίνη που σχετίζεται με την κυτταρική ανάπτυξη και αγγειογένεση (33), ένα άλλο μέλος του Μ18. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, το AsymAD αυξήθηκε σημαντικά, ακολουθούμενο από μεγαλύτερη αύξηση της AD. Αντίθετα, η συναπτική πρωτεΐνη νευροπενταξίνη 2 (NPTX2) μειώθηκε σημαντικά στον εγκέφαλο AsymAD. Η NPTX2 είχε συσχετιστεί προηγουμένως με νευροεκφυλισμό και έχει αναγνωρισμένο ρόλο στη μεσολάβηση των διεγερτικών συνάψεων (34). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν μια ποικιλία διαφορετικών προκλινικών αλλαγών πρωτεΐνης στην AD που φαίνεται να εξελίσσονται με τη σοβαρότητα της νόσου.
Δεδομένου ότι έχουμε επιτύχει ένα σημαντικό βάθος κάλυψης πρωτεΐνης στην ανακάλυψη του πρωτεώματος του εγκεφάλου, προσπαθούμε να κατανοήσουμε πληρέστερα την επικάλυψη του με το μεταγραφικό AD σε επίπεδο δικτύου. Ως εκ τούτου, συγκρίναμε το πρωτεόμιο του εγκεφάλου που ανακαλύψαμε με τη μονάδα που δημιουργήσαμε προηγουμένως από τη μέτρηση μικροσυστοιχίας 18.204 γονιδίων σε ιστούς AD (n = 308) και ελέγχου (n = 157) DLPFC (13). επικάλυψη. Συνολικά, εντοπίσαμε 20 διαφορετικές μονάδες RNA, πολλές από τις οποίες έδειξαν τον εμπλουτισμό συγκεκριμένων τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των νευρώνων, των ολιγοδενδροκυττάρων, των αστροκυττάρων και της μικρογλοίας (Εικόνα 3Α). Οι πολλαπλές αλλαγές αυτών των μονάδων στο AD φαίνονται στο Σχήμα 3Β. Σε συμφωνία με την προηγούμενη ανάλυση επικάλυψης πρωτεΐνης-RNA χρησιμοποιώντας το βαθύτερο μη επισημασμένο πρωτεϊνικό MS (περίπου 3000 πρωτεΐνες) (13), οι περισσότερες από τις 44 μονάδες στο δίκτυο πρωτεώματος του εγκεφάλου που βρήκαμε βρίσκονται στο δίκτυο μεταγραφών Δεν υπάρχει σημαντική επικάλυψη. Η ανακάλυψη και η αντιγραφή των 34 πρωτεϊνικών μονάδων που διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό στο πρωτεϊνό του εγκεφάλου, μόνο 14 (~40%) πέρασαν το ακριβές τεστ Fisher (FET) αποδείχθηκε ότι είχαν στατιστικά σημαντική επικάλυψη με το μεταγραφικό (Εικόνα 3Α) . Συμβατό με επιδιόρθωση βλάβης στο DNA (P-M25 και P-M19), μετάφραση πρωτεϊνών (P-M7 και P-M20), σύνδεση/μάτισμα RNA (P-M16 και P-M21) και στόχευση πρωτεΐνης (P-M13 και P- M23) δεν επικαλύπτεται με τις ενότητες στο μεταγραφικό. Επομένως, παρόλο που χρησιμοποιείται ένα βαθύτερο σύνολο δεδομένων πρωτεώματος στην τρέχουσα ανάλυση επικάλυψης (13), το μεγαλύτερο μέρος του πρωτεώματος του δικτύου AD δεν αντιστοιχίζεται στο δίκτυο μεταγραφής.
(Α) Το υπεργεωμετρικό FET καταδεικνύει τον εμπλουτισμό των κυτταρικού τύπου δεικτών στη μονάδα RNA του μεταγραφώματος AD (επάνω) και τον βαθμό επικάλυψης μεταξύ των μονάδων RNA (άξονας x) και πρωτεΐνης (άξονας y) του εγκεφάλου AD (κάτω) . Η ένταση της κόκκινης σκίασης υποδεικνύει τον βαθμό εμπλουτισμού των τύπων κυψελών στο επάνω πλαίσιο και την ένταση της επικάλυψης των μονάδων στον κάτω πίνακα. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημασία (P <0,05). (Β) Ο βαθμός συσχέτισης μεταξύ των χαρακτηριστικών γονιδίων κάθε ενότητας μεταγραφώματος και της κατάστασης AD. Οι μονάδες στα αριστερά έχουν την πιο αρνητική συσχέτιση με το AD (μπλε), και εκείνες στα δεξιά είναι οι πιο θετικά συσχετισμένες με το AD (κόκκινο). Η λογαριθμικά μετασχηματισμένη BH-διορθωμένη τιμή P υποδεικνύει τον βαθμό στατιστικής σημασίας κάθε συσχέτισης. (Γ) Σημαντικές επικαλυπτόμενες μονάδες με κοινόχρηστο εμπλουτισμό τύπου κυψέλης. (D) Ανάλυση συσχέτισης της αλλαγής log2 φορές της επισημασμένης πρωτεΐνης (άξονας x) και RNA (άξονας γ) στην επικαλυπτόμενη μονάδα. Εμφανίζεται ο συντελεστής συσχέτισης Pearson με τη σχετική τιμή P. Micro, microglia; ουράνια σώματα, αστροκύτταρα. CT, έλεγχος.
Οι περισσότερες επικαλυπτόμενες μονάδες πρωτεΐνης και RNA μοιράζονται παρόμοια προφίλ εμπλουτισμού κυτταρικού τύπου και συνεπείς κατευθύνσεις αλλαγής AD (Εικόνα 3, Β και Γ). Με άλλα λόγια, η σχετιζόμενη με τη σύναψη μονάδα M1 του πρωτεώματος του εγκεφάλου (PM1) χαρτογραφείται σε τρεις ομόλογες μονάδες RNA πλούσιες σε νευρώνες (R-M1, R-M9 και R-M16), οι οποίες βρίσκονται στην AD Και οι δύο έδειξαν μειωμένο επίπεδο. Ομοίως, οι πλούσιες σε γλοιακές μονάδες πρωτεΐνης M5 και M18 επικαλύπτονται με μονάδες RNA πλούσιες σε αστροκύτταρα και μικρογλοιακούς δείκτες (R-M3, R-M7 και R-M10) και εμπλέκονται σε μεγάλο βαθμό στην Αύξηση ασθενειών. Αυτά τα κοινά αρθρωτά χαρακτηριστικά μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων υποστηρίζουν περαιτέρω τον εμπλουτισμό του κυτταρικού τύπου και τις αλλαγές που σχετίζονται με την ασθένεια που έχουμε παρατηρήσει στο πρωτεόμιο του εγκεφάλου. Ωστόσο, παρατηρήσαμε πολλές σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιπέδων RNA και πρωτεΐνης μεμονωμένων δεικτών σε αυτές τις κοινές ενότητες. Η ανάλυση συσχέτισης της διαφορικής έκφρασης της πρωτεϊνομικής και της μεταγραφτομικής των μορίων εντός αυτών των επικαλυπτόμενων μονάδων (Εικόνα 3D) υπογραμμίζει αυτήν την ασυνέπεια. Για παράδειγμα, η APP και αρκετές άλλες πρωτεΐνες γλοιακής μονάδας (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 και SFRP1) έδειξαν σημαντική αύξηση στο πρωτεϊνικό AD, αλλά δεν υπήρξε σχεδόν καμία αλλαγή στο μεταγραφικό AD. Αυτές οι ειδικές για την πρωτεΐνη αλλαγές μπορεί να σχετίζονται στενά με τις αμυλοειδείς πλάκες (23, 35), υπογραμμίζοντας το πρωτεϊνό ως την πηγή παθολογικών αλλαγών και αυτές οι αλλαγές μπορεί να μην αντικατοπτρίζονται στο μεταγραφικό.
Μετά από ανεξάρτητη ανάλυση των πρωτεωμάτων του εγκεφάλου και του ΕΝΥ που ανακαλύψαμε, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση των δύο συνόλων δεδομένων για τον εντοπισμό βιοδεικτών AD CSF που σχετίζονται με την παθοφυσιολογία του εγκεφαλικού δικτύου. Πρέπει πρώτα να ορίσουμε την επικάλυψη των δύο πρωτεωμάτων. Αν και είναι ευρέως αποδεκτό ότι το ΕΝΥ αντανακλά νευροχημικές αλλαγές στον εγκέφαλο AD (4), ο ακριβής βαθμός επικάλυψης μεταξύ του εγκεφάλου AD και του πρωτεώματος του ΕΝΥ είναι ασαφής. Συγκρίνοντας τον αριθμό των κοινών γονιδιακών προϊόντων που ανιχνεύθηκαν στα δύο πρωτεώματά μας, βρήκαμε ότι σχεδόν το 70% (n = 1936) των πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ποσοτικοποιήθηκαν επίσης στον εγκέφαλο (Εικόνα 4Α). Οι περισσότερες από αυτές τις επικαλυπτόμενες πρωτεΐνες (n = 1721) αντιστοιχίζονται σε μία από τις 44 μονάδες συνέκφρασης από το σύνολο δεδομένων του εγκεφάλου ανακάλυψης (Εικόνα 4Β). Όπως αναμενόταν, οι έξι μεγαλύτερες μονάδες εγκεφάλου (Μ1 έως Μ6) εμφάνισαν τη μεγαλύτερη επικάλυψη ΕΝΥ. Ωστόσο, υπάρχουν μικρότερες μονάδες εγκεφάλου (για παράδειγμα, M15 και M29) που επιτυγχάνουν έναν απροσδόκητα υψηλό βαθμό επικάλυψης, μεγαλύτερο από μια μονάδα εγκεφάλου διπλάσιου μεγέθους. Αυτό μας παρακινεί να υιοθετήσουμε μια πιο λεπτομερή, στατιστικά καθοδηγούμενη μέθοδο για τον υπολογισμό της επικάλυψης μεταξύ του εγκεφάλου και του εγκεφαλονωτιαίου υγρού.
(Α και Β) Οι πρωτεΐνες που ανιχνεύονται στα σύνολα δεδομένων του εγκεφάλου ανακάλυψης και του ΕΝΥ επικαλύπτονται. Οι περισσότερες από αυτές τις επικαλυπτόμενες πρωτεΐνες σχετίζονται με μία από τις 44 μονάδες συνέκφρασης του δικτύου συνέκφρασης του εγκεφάλου. (Γ) Ανακαλύψτε την επικάλυψη μεταξύ του πρωτεώματος του εγκεφαλονωτιαίου υγρού και του πρωτεώματος του εγκεφαλικού δικτύου. Κάθε σειρά του χάρτη θερμότητας αντιπροσωπεύει μια ξεχωριστή ανάλυση επικάλυψης του υπεργεωμετρικού FET. Η επάνω σειρά απεικονίζει την επικάλυψη (γκρι/μαύρη σκίαση) μεταξύ της μονάδας εγκεφάλου και ολόκληρου του πρωτεώματος του ΕΝΥ. Η δεύτερη γραμμή απεικονίζει ότι η επικάλυψη μεταξύ των μονάδων του εγκεφάλου και της πρωτεΐνης ΕΝΥ (σκιασμένη με κόκκινο χρώμα) ρυθμίζεται σημαντικά προς τα πάνω στην AD (P <0,05). Η τρίτη σειρά δείχνει ότι η επικάλυψη μεταξύ των μονάδων του εγκεφάλου και της πρωτεΐνης του ΕΝΥ (μπλε σκίαση) ρυθμίζεται σημαντικά προς τα κάτω στην AD (P <0,05). Χρησιμοποιήστε τη μέθοδο BH για να διορθώσετε την τιμή P που προέρχεται από το FET. (D) Πτυσσόμενο πάνελ μονάδας που βασίζεται σε συσχετισμό τύπων κυψέλης και σχετικούς όρους GO. Αυτά τα πάνελ περιέχουν συνολικά 271 πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον εγκέφαλο, οι οποίες έχουν σημαντική διαφορική έκφραση στο πρωτεϊνικό ΕΝΥ.
Χρησιμοποιώντας FET με μονή ουρά, αξιολογήσαμε τη σημασία της επικάλυψης πρωτεΐνης μεταξύ του πρωτεώματος του ΕΝΥ και των μεμονωμένων μονάδων του εγκεφάλου. Η ανάλυση αποκάλυψε ότι συνολικά 14 μονάδες εγκεφάλου στο σύνολο δεδομένων ΕΝΥ έχουν στατιστικά σημαντικές επικαλύψεις (προσαρμοσμένο με FDR P <0,05) και μια πρόσθετη ενότητα (M18) της οποίας η επικάλυψη είναι κοντά στη σημασία (Ρυθμισμένη με FDR P = 0,06) (Εικόνα 4C , επάνω σειρά). Μας ενδιαφέρουν επίσης οι ενότητες που αλληλεπικαλύπτονται έντονα με πρωτεΐνες ΕΝΥ με διαφορική έκφραση. Ως εκ τούτου, εφαρμόσαμε δύο πρόσθετες αναλύσεις FET για να προσδιορίσουμε ποια από (i) πρωτεΐνη ΕΝΥ ήταν σημαντικά αυξημένη στην AD και (ii) η πρωτεΐνη ΕΝΥ μειώθηκε σημαντικά στην AD (P <0,05, ζεύγη τεστ AD/έλεγχος) Ενότητες εγκεφάλου με σημαντική επικάλυψη ανάμεσά τους. Όπως φαίνεται στη μεσαία και κάτω σειρά του Σχήματος 4C, αυτές οι πρόσθετες αναλύσεις δείχνουν ότι 8 από τις 44 μονάδες εγκεφάλου επικαλύπτονται σημαντικά με την πρωτεΐνη που προστίθεται στο AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 και M38) . ), ενώ μόνο δύο μονάδες (Μ6 και Μ15) έδειξαν σημαντική επικάλυψη με τη μειωμένη πρωτεΐνη στο AD CSF. Όπως ήταν αναμενόμενο, και οι 10 μονάδες βρίσκονται στις 15 ενότητες με την υψηλότερη επικάλυψη με το πρωτεϊνικό ΕΝΥ. Επομένως, υποθέτουμε ότι αυτές οι 15 ενότητες είναι πηγές υψηλής απόδοσης βιοδεικτών ΕΝΥ εγκεφάλου AD.
Διπλώσαμε αυτές τις 15 επικαλυπτόμενες μονάδες σε πέντε μεγάλα πάνελ πρωτεϊνών με βάση την εγγύτητά τους στο δενδρικό διάγραμμα WGCNA και τη συσχέτισή τους με κυτταρικούς τύπους και γονιδιακή οντολογία (Εικόνα 4D). Το πρώτο πάνελ περιέχει ενότητες πλούσιες σε δείκτες νευρώνων και πρωτεΐνες που σχετίζονται με τις συνάψεις (M1 και M12). Το συναπτικό πλαίσιο περιέχει συνολικά 94 πρωτεΐνες και τα επίπεδα στο πρωτεϊνικό ΕΝΥ έχουν αλλάξει σημαντικά, καθιστώντας το τη μεγαλύτερη πηγή δεικτών ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο μεταξύ των πέντε ομάδων. Η δεύτερη ομάδα (Μ6 και Μ15) έδειξε τη στενή σύνδεση με δείκτες ενδοθηλιακών κυττάρων και το αγγειακό σώμα, όπως η «επούλωση τραυμάτων» (Μ6) και η «ρύθμιση της χυμικής ανοσολογικής απόκρισης» (Μ15). Το M15 σχετίζεται επίσης σε μεγάλο βαθμό με τον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών, ο οποίος σχετίζεται στενά με το ενδοθήλιο (36). Το αγγειακό πλαίσιο περιέχει 34 δείκτες ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο. Η τρίτη ομάδα περιλαμβάνει ενότητες (Μ2 και Μ4) που σχετίζονται σημαντικά με τους δείκτες ολιγοδενδροκυττάρων και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Για παράδειγμα, οι όροι οντολογίας ανώτατου επιπέδου του M2 περιλαμβάνουν «θετική ρύθμιση της αντιγραφής DNA» και «διαδικασία βιοσύνθεσης πουρινών». Εν τω μεταξύ, αυτά του Μ4 περιλαμβάνουν «διαφοροποίηση γλοιακών κυττάρων» και «διαχωρισμό χρωμοσωμάτων». Το πλαίσιο μυελίνωσης περιέχει 49 δείκτες ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο.
Η τέταρτη ομάδα περιέχει τις περισσότερες ενότητες (M30, M29, M18, M24 και M5) και σχεδόν όλες οι μονάδες είναι σημαντικά πλούσιες σε μικρογλοία και δείκτες αστροκυττάρων. Παρόμοια με το πλαίσιο μυελίνωσης, το τέταρτο πλαίσιο περιέχει επίσης ενότητες (M30, M29 και M18) που σχετίζονται στενά με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Οι άλλες ενότητες αυτής της ομάδας σχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με ανοσολογικούς όρους, όπως «διαδικασία ανοσολογικού αποτελέσματος» (M5) και «ρύθμιση ανοσοαπόκρισης» (M24). Η νευρογλοιακή ομάδα περιέχει 42 δείκτες ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο. Τέλος, το τελευταίο πάνελ περιλαμβάνει 52 δείκτες που σχετίζονται με τον εγκέφαλο στις τέσσερις ενότητες (M44, M3, M33 και M38), οι οποίοι βρίσκονται στο σώμα και σχετίζονται με την αποθήκευση ενέργειας και το μεταβολισμό. Η μεγαλύτερη από αυτές τις μονάδες (M3) σχετίζεται στενά με τα μιτοχόνδρια και είναι πλούσια σε ειδικούς δείκτες νευρώνων. Το M38 είναι ένα από τα μικρότερα μέλη σε αυτό το μεταβολίωμα και επίσης εμφανίζει μέτρια ειδικότητα νευρώνων.
Συνολικά, αυτά τα πέντε πλαίσια αντικατοπτρίζουν ένα ευρύ φάσμα τύπων κυττάρων και λειτουργιών στον φλοιό της AD και συλλογικά περιέχουν 271 δείκτες ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο (Πίνακας S2G). Για να αξιολογήσουμε την εγκυρότητα αυτών των αποτελεσμάτων MS, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία επέκτασης εγγύτητας (PEA), μια τεχνολογία που βασίζεται σε ορθογώνια αντισώματα με δυνατότητες πολυπλεξίας, υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, και αναλύσαμε εκ νέου τα δείγματα εγκεφαλονωτιαίου υγρού που βρήκαμε Ένα υποσύνολο αυτών των 271 βιοδεικτών (n = 36). Αυτοί οι 36 στόχοι καταδεικνύουν την αλλαγή στο πολλαπλάσιο AD της PEA, η οποία σχετίζεται στενά με τα ευρήματά μας που βασίζονται στο MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), τα οποία επαλήθευσαν έντονα τα αποτελέσματα της περιεκτικής μας ανάλυσης MS (Εικόνα S4 ).
Τα βιολογικά θέματα που τονίζονται από τις πέντε ομάδες μας, από τη συναπτική σηματοδότηση έως τον ενεργειακό μεταβολισμό, σχετίζονται όλα με την παθογένεση της AD (1-3). Επομένως, και οι 15 ενότητες που περιέχουν αυτά τα πάνελ σχετίζονται με την παθολογία της AD στο πρωτεϊνό του εγκεφάλου που ανακαλύψαμε (Εικόνα 2Β). Η πιο αξιοσημείωτη είναι η υψηλή θετική παθολογική συσχέτιση μεταξύ των νευρογλοιακών μας μονάδων και η ισχυρή αρνητική παθολογική συσχέτιση μεταξύ των μεγαλύτερων νευρωνικών μας μονάδων (Μ1 και Μ3). Η ανάλυση διαφορικής έκφρασης του αντιγραφόμενου πρωτεώματος του εγκεφάλου μας (Εικόνα S3D) υπογραμμίζει επίσης τις πρωτεΐνες γλοίας που προέρχονται από M5 και M18. Στο AsymAD και στη συμπτωματική ΝΑ, οι πιο αυξημένες γλοιακές πρωτεΐνες και συνάψεις που σχετίζονται με το Μ1 Η πρωτεΐνη μειώνεται περισσότερο. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι οι 271 δείκτες εγκεφαλονωτιαίου υγρού που εντοπίσαμε στις πέντε ομάδες σχετίζονται με διαδικασίες ασθένειας στον φλοιό της AD, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εμφανίζονται στα πρώιμα ασυμπτωματικά στάδια.
Για να αναλύσουμε καλύτερα την κατεύθυνση αλλαγής των πρωτεϊνών του πίνακα στον εγκέφαλο και το νωτιαίο υγρό, σχεδιάσαμε τα ακόλουθα για καθεμία από τις 15 επικαλυπτόμενες ενότητες: (i) βρήκαμε το επίπεδο αφθονίας της μονάδας στο σύνολο δεδομένων εγκεφάλου και (ii) τη μονάδα πρωτεΐνη Η διαφορά εκφράζεται στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Εικόνα S5). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το WGCNA χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της αφθονίας των μονάδων ή της χαρακτηριστικής τιμής πρωτεΐνης στον εγκέφαλο (13). Ο χάρτης ηφαιστείων χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη διαφορική έκφραση των αρθρωτών πρωτεϊνών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (AD/μάρτυρας). Αυτά τα σχήματα δείχνουν ότι τρία από τα πέντε πλαίσια δείχνουν διαφορετικές τάσεις έκφρασης στον εγκέφαλο και το νωτιαίο υγρό. Οι δύο μονάδες του πίνακα συνάψεων (Μ1 και Μ12) δείχνουν μείωση στο επίπεδο αφθονίας στον εγκέφαλο AD, αλλά επικαλύπτονται σημαντικά με την αυξημένη πρωτεΐνη στο AD CSF (Εικόνα S5A). Οι σχετιζόμενες με τον νευρώνα δομοστοιχεία που περιέχουν το μεταβολίωμα (Μ3 και Μ38) έδειξαν παρόμοια πρότυπα έκφρασης του εγκεφάλου και του εγκεφαλονωτιαίου υγρού ασυνεπή (Εικόνα S5E). Το αγγειακό πάνελ έδειξε επίσης διαφορετικές τάσεις έκφρασης, αν και οι ενότητες του (Μ6 και Μ15) ήταν μέτρια αυξημένες στον εγκέφαλο AD και μειώθηκαν στο άρρωστο ΕΝΥ (Εικόνα S5B). Τα υπόλοιπα δύο πάνελ περιέχουν μεγάλα νευρογλοιακά δίκτυα των οποίων οι πρωτεΐνες ρυθμίζονται σταθερά προς τα πάνω και στα δύο διαμερίσματα (Εικόνα S5, C και D).
Λάβετε υπόψη ότι αυτές οι τάσεις δεν είναι κοινές σε όλους τους δείκτες σε αυτά τα πλαίσια. Για παράδειγμα, το συναπτικό πάνελ περιλαμβάνει αρκετές πρωτεΐνες που μειώνονται σημαντικά στον εγκέφαλο AD και στο ΕΝΥ (Εικόνα S5A). Μεταξύ αυτών των δεικτών εγκεφαλονωτιαίου υγρού που ρυθμίζονται προς τα κάτω είναι οι NPTX2 και VGF του Μ1 και η χρωμογρανίνη Β του Μ12. Ωστόσο, παρά αυτές τις εξαιρέσεις, οι περισσότεροι από τους συναπτικούς δείκτες μας είναι αυξημένοι στο AD νωτιαίο υγρό. Συνολικά, αυτές οι αναλύσεις μπόρεσαν να διακρίνουν στατιστικά σημαντικές τάσεις στα επίπεδα του εγκεφάλου και του εγκεφαλονωτιαίου υγρού σε καθένα από τα πέντε πάνελ μας. Αυτές οι τάσεις υπογραμμίζουν τη σύνθετη και συχνά διαφορετική σχέση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης του εγκεφάλου και του ΕΝΥ στην AD.
Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση αντιγραφής MS υψηλής απόδοσης (αντιγραφή CSF 1) για να περιορίσουμε το σύνολο 271 βιοδεικτών μας στους πιο υποσχόμενους και αναπαραγώγιμους στόχους (Εικόνα 5Α). Το αντίγραφο 1 του ΕΝΥ περιέχει συνολικά 96 δείγματα από το Emory Goizueta ADRC, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου, του AsymAD και της κοόρτης AD (Πίνακας S1A). Αυτές οι περιπτώσεις AD χαρακτηρίζονται από ήπια γνωστική έκπτωση (μέση τιμή MoCA, 20,0 ± 3,8) και αλλαγές στους βιοδείκτες AD που επιβεβαιώνονται στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Πίνακας S1A). Σε αντίθεση με την ανάλυση ΕΝΥ που βρήκαμε, αυτή η αναπαραγωγή εκτελείται χρησιμοποιώντας μια πιο αποτελεσματική και υψηλής απόδοσης μέθοδο "single-shot" MS (χωρίς κλασματοποίηση off-line), συμπεριλαμβανομένου ενός απλοποιημένου πρωτοκόλλου προετοιμασίας δειγμάτων που εξαλείφει την ανάγκη για ανοσοεξάντληση μεμονωμένων δειγμάτων . Αντίθετα, χρησιμοποιείται ένα μεμονωμένο «κανάλι ενίσχυσης» με μειωμένο ανοσοποιητικό για την ενίσχυση του σήματος των λιγότερο άφθονων πρωτεϊνών (37). Αν και μειώνει τη συνολική κάλυψη πρωτεώματος, αυτή η μέθοδος μονής λήψης μειώνει σημαντικά τον χρόνο της μηχανής και αυξάνει τον αριθμό των δειγμάτων με επισήμανση TMT που μπορούν να αναλυθούν βιώσιμα (17, 38). Συνολικά, η ανάλυση εντόπισε 6.487 πεπτίδια, τα οποία χαρτογραφήθηκαν σε 1.183 πρωτεώματα σε 96 περιπτώσεις. Όπως και με την ανάλυση ΕΝΥ που βρήκαμε, μόνο εκείνες οι πρωτεΐνες που ποσοτικοποιήθηκαν σε τουλάχιστον 50% των δειγμάτων συμπεριλήφθηκαν στους επόμενους υπολογισμούς και τα δεδομένα υποχώρησαν για τις επιπτώσεις της ηλικίας και του φύλου. Αυτό οδήγησε στον τελικό ποσοτικό προσδιορισμό 792 πρωτεωμάτων, το 95% των οποίων ταυτοποιήθηκε επίσης στο σύνολο δεδομένων ΕΝΥ που βρέθηκε.
(Α) Στόχοι πρωτεΐνης ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο που επαληθεύτηκαν στην πρώτη αναπαραγόμενη κοόρτη ΕΝΥ και συμπεριλήφθηκαν στο τελικό πλαίσιο (n = 60). (Β έως Ε) Επίπεδα βιοδεικτών πάνελ (σύνθετοι βαθμοί z) που μετρήθηκαν στις τέσσερις κοόρτες αντιγραφής του ΕΝΥ. Χρησιμοποιήθηκαν ζευγοποιημένες δοκιμές t ή ANOVA με μεταδιόρθωση Tukey για την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας των αλλαγών σε αφθονία σε κάθε επαναληπτική ανάλυση. CT, έλεγχος.
Δεδομένου ότι μας ενδιαφέρει ιδιαίτερα να επαληθεύσουμε τους 271 στόχους ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο μέσω ολοκληρωμένης ανάλυσης, θα περιορίσουμε την περαιτέρω εξέταση αυτού του αναπαραγόμενου πρωτεώματος σε αυτούς τους δείκτες. Μεταξύ αυτών των 271 πρωτεϊνών, 100 ανιχνεύθηκαν στον αναδιπλασιασμό 1 του ΕΝΥ. Το Σχήμα S6A δείχνει τη διαφορική έκφραση αυτών των 100 επικαλυπτόμενων δεικτών μεταξύ του ελέγχου και των δειγμάτων αντιγραφής AD. Οι συναπτικές ιστόνες και οι ιστόνες του μεταβολίτη αυξάνονται περισσότερο στην AD, ενώ οι αγγειακές πρωτεΐνες μειώνονται περισσότερο στη νόσο. Οι περισσότεροι από τους 100 επικαλυπτόμενους δείκτες (n = 70) διατήρησαν την ίδια κατεύθυνση αλλαγής στα δύο σύνολα δεδομένων (Εικόνα S6B). Αυτοί οι 70 επικυρωμένοι δείκτες ΕΝΥ που σχετίζονται με τον εγκέφαλο (Πίνακας S2H) αντικατοπτρίζουν σε μεγάλο βαθμό τις τάσεις έκφρασης του πάνελ που παρατηρήθηκαν προηγουμένως, δηλαδή την προς τα κάτω ρύθμιση των αγγειακών πρωτεϊνών και την προς τα πάνω ρύθμιση όλων των άλλων πλαισίων. Μόνο 10 από αυτές τις 70 επικυρωμένες πρωτεΐνες έδειξαν αλλαγές στην αφθονία της AD που έρχονται σε αντίθεση με αυτές τις τάσεις του πάνελ. Προκειμένου να δημιουργήσουμε ένα πάνελ που αντικατοπτρίζει καλύτερα τη συνολική τάση του εγκεφάλου και του εγκεφαλονωτιαίου υγρού, αποκλείσαμε αυτές τις 10 πρωτεΐνες από το πάνελ ενδιαφέροντος που τελικά επαληθεύσαμε (Εικόνα 5Α). Ως εκ τούτου, το πάνελ μας περιλαμβάνει τελικά συνολικά 60 πρωτεΐνες που έχουν επαληθευτεί σε δύο ανεξάρτητες κοόρτες AD CSF χρησιμοποιώντας διαφορετική προετοιμασία δειγμάτων και ανάλυση πλατφόρμας MS. Οι γραφικές παραστάσεις έκφρασης βαθμολογίας z αυτών των τελικών πλαισίων στις περιπτώσεις ελέγχου αντιγράφου 1 CSF και AD επιβεβαίωσαν την τάση του πίνακα που παρατηρήθηκε στην κοόρτη CSF που βρήκαμε (Εικόνα 5Β).
Μεταξύ αυτών των 60 πρωτεϊνών, υπάρχουν μόρια που είναι γνωστό ότι σχετίζονται με την AD, όπως η οστεοποντίνη (SPP1), η οποία είναι μια προφλεγμονώδης κυτοκίνη που έχει συσχετιστεί με την AD σε πολλές μελέτες (39-41), και το GAP43, μια συναπτική πρωτεΐνη που συνδέεται σαφώς με τον νευροεκφυλισμό (42). Οι πιο πλήρως επαληθευμένες πρωτεΐνες είναι δείκτες που σχετίζονται με άλλες νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η υπεροξειδική δισμουτάση 1 (SOD1) που σχετίζεται με την αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση (ALS) και η δεσακχαράση που σχετίζεται με τη νόσο του Πάρκινσον (PARK7). Επαληθεύσαμε επίσης ότι πολλοί άλλοι δείκτες, όπως το SMOC1 και η πλούσια σε εγκέφαλο πρωτεΐνη σηματοδότησης προσκόλλησης μεμβράνης 1 (BASP1), έχουν περιορισμένες προηγούμενες συνδέσεις με τον νευροεκφυλισμό. Αξίζει να σημειωθεί ότι λόγω της χαμηλής συνολικής τους αφθονίας στο πρωτεϊνικό ΕΝΥ, είναι δύσκολο για εμάς να χρησιμοποιήσουμε αυτήν τη μέθοδο ανίχνευσης μίας λήψης υψηλής απόδοσης για να ανιχνεύσουμε αξιόπιστα το MAPT και ορισμένες άλλες πρωτεΐνες που σχετίζονται με την AD (για παράδειγμα, NEFL και NRGN ) (43, 44).
Στη συνέχεια, ελέγξαμε αυτούς τους 60 δείκτες πίνακα προτεραιότητας σε τρεις πρόσθετες επαναληπτικές αναλύσεις. Στο αντίγραφο 2 του ΕΝΥ, χρησιμοποιήσαμε ένα μόνο TMT-MS για να αναλύσουμε μια ανεξάρτητη κοόρτη 297 δειγμάτων ελέγχου και AD από την Emory Goizueta ADRC (17). Η αντιγραφή ΕΝΥ 3 περιελάμβανε μια εκ νέου ανάλυση των διαθέσιμων δεδομένων TMT-MS από 120 ασθενείς ελέγχου και AD από τη Λωζάνη της Ελβετίας (45). Εντοπίσαμε περισσότερα από τα δύο τρίτα των 60 δεικτών προτεραιότητας σε κάθε σύνολο δεδομένων. Αν και η ελβετική μελέτη χρησιμοποίησε διαφορετικές πλατφόρμες MS και μεθόδους ποσοτικοποίησης TMT (45, 46), αναπαράγαμε έντονα τις τάσεις του πάνελ μας σε δύο επαναλαμβανόμενες αναλύσεις (Εικόνα 5, Γ και Δ και Πίνακες S2, I και J) . Για να αξιολογήσουμε την ειδικότητα της νόσου της ομάδας μας, χρησιμοποιήσαμε το TMT-MS για να αναλύσουμε το τέταρτο σύνολο δεδομένων αναπαραγωγής (αντιγραφή CSF 4), το οποίο περιελάμβανε όχι μόνο περιπτώσεις ελέγχου (n = 18) και AD (n = 17), αλλά και PD ( n = 14)), δείγματα ALS (n = 18) και μετωποκροταφικής άνοιας (FTD) (n = 11) (Πίνακας S1A). Ποσοτικοποιήσαμε με επιτυχία σχεδόν τα δύο τρίτα των πρωτεϊνών του πίνακα σε αυτήν την κοόρτη (38 από 60). Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τις ειδικές για το AD αλλαγές και στα πέντε πλαίσια βιοδεικτών (Εικόνα 5Ε και Πίνακας S2K). Η αύξηση στην ομάδα μεταβολιτών έδειξε την ισχυρότερη ειδικότητα AD, ακολουθούμενη από την ομάδα μυελίνωσης και γλοιακής ομάδας. Σε μικρότερο βαθμό, το FTD δείχνει επίσης μια αύξηση μεταξύ αυτών των πλαισίων, η οποία μπορεί να αντανακλά παρόμοιες πιθανές αλλαγές δικτύου (17). Αντίθετα, το ALS και το PD έδειξαν σχεδόν τα ίδια προφίλ μυελίνωσης, γλοιακής και μεταβολισμού με την ομάδα ελέγχου. Συνολικά, παρά τις διαφορές στην προετοιμασία δειγμάτων, την πλατφόρμα MS και τις μεθόδους ποσοτικοποίησης TMT, αυτές οι επαναλαμβανόμενες αναλύσεις δείχνουν ότι οι δείκτες πάνελ προτεραιότητάς μας έχουν εξαιρετικά συνεπείς αλλαγές ειδικές για το AD σε περισσότερα από 500 μοναδικά δείγματα ΕΝΥ.
Ο νευροεκφυλισμός της AD έχει αναγνωριστεί ευρέως αρκετά χρόνια πριν από την έναρξη των γνωστικών συμπτωμάτων, επομένως υπάρχει επείγουσα ανάγκη για βιοδείκτες του AsymAD (5, 31). Ωστόσο, όλο και περισσότερα στοιχεία δείχνουν ότι η βιολογία του AsymAD απέχει πολύ από το να είναι ομοιογενής και η πολύπλοκη αλληλεπίδραση κινδύνου και ανθεκτικότητας οδηγεί σε μεγάλες ατομικές διαφορές στην επακόλουθη εξέλιξη της νόσου (47). Αν και χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό περιπτώσεων AsymAD, τα επίπεδα των βιοδεικτών του πυρήνα του ΕΝΥ (Aβ1-42, ολική ταυ και p-tau) δεν έχουν αποδειχθεί ότι μπορούν να προβλέψουν αξιόπιστα ποιος θα εξελιχθεί σε άνοια (4, 7), υποδεικνύοντας περισσότερα. είναι απαραίτητο να συμπεριληφθούν ολιστικά εργαλεία βιοδεικτών που βασίζονται σε πολλαπλές πτυχές της φυσιολογίας του εγκεφάλου για την ακριβή διαστρωμάτωση του κινδύνου αυτού του πληθυσμού. Επομένως, αναλύσαμε στη συνέχεια το επικυρωμένο με AD πάνελ βιοδεικτών στον πληθυσμό AsymAD του αντιγράφου 1 του ΕΝΥ. Αυτές οι 31 περιπτώσεις AsymAD έδειξαν μη φυσιολογικά επίπεδα βιοδεικτών πυρήνα (Αβ1–42/συνολική αναλογία tau ELISA, <5,5) και πλήρη γνωστική ικανότητα (μέσος όρος MoCA, 271. ± 2,2) (Πίνακας S1A). Επιπλέον, όλα τα άτομα με AsymAD έχουν βαθμολογία κλινικής άνοιας 0, υποδεικνύοντας ότι δεν υπάρχουν ενδείξεις μείωσης της καθημερινής γνωστικής ή λειτουργικής απόδοσης.
Αρχικά αναλύσαμε τα επίπεδα των επικυρωμένων πλαισίων και στα 96 αντίγραφα του CSF 1, συμπεριλαμβανομένης της κοόρτης AsymAD. Βρήκαμε ότι αρκετά πάνελ στην ομάδα AsymAD είχαν σημαντικές αλλαγές αφθονίας που μοιάζουν με AD, το αγγειακό πάνελ παρουσίασε πτωτική τάση στο AsymAD, ενώ όλα τα άλλα πάνελ παρουσίασαν ανοδική τάση (Εικόνα 6Α). Επομένως, όλα τα πάνελ έδειξαν μια εξαιρετικά σημαντική συσχέτιση με τα επίπεδα ELISA Aβ1-42 και τα συνολικά επίπεδα tau (Εικόνα 6Β). Αντίθετα, η συσχέτιση μεταξύ της ομάδας και της βαθμολογίας του MoCA είναι σχετικά φτωχή. Ένα από τα πιο εντυπωσιακά ευρήματα από αυτές τις αναλύσεις είναι το μεγάλο εύρος αφθονίας πάνελ στην κοόρτη AsymAD. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, το επίπεδο πάνελ της ομάδας AsymAD συνήθως διασχίζει το επίπεδο πίνακα της ομάδας ελέγχου και της ομάδας AD, παρουσιάζοντας σχετικά υψηλή μεταβλητότητα. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω αυτήν την ετερογένεια του AsymAD, εφαρμόσαμε ανάλυση Πολυδιάστατης Κλιμάκωσης (MDS) σε 96 περιπτώσεις αναπαραγωγής 1 ΕΝΥ. Η ανάλυση MDS επιτρέπει την οπτικοποίηση της ομοιότητας μεταξύ των περιπτώσεων με βάση ορισμένες μεταβλητές στο σύνολο δεδομένων. Για αυτήν την ανάλυση συμπλέγματος, χρησιμοποιούμε μόνο εκείνους τους επικυρωμένους δείκτες πάνελ που έχουν στατιστικά σημαντική αλλαγή (P <0,05, AD/έλεγχος) στο επίπεδο ανακάλυψης και αναπαραγωγής 1 του ΕΝΥ (n = 29) (Πίνακας S2L). Αυτή η ανάλυση παρήγαγε σαφή χωρική ομαδοποίηση μεταξύ των περιπτώσεων ελέγχου μας και AD (Εικόνα 6Γ). Αντίθετα, ορισμένες περιπτώσεις AsymAD συγκεντρώνονται σαφώς στην ομάδα ελέγχου, ενώ άλλες εντοπίζονται σε περιπτώσεις AD. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω αυτήν την ετερογένεια AsymAD, χρησιμοποιήσαμε τον χάρτη MDS μας για να ορίσουμε δύο ομάδες από αυτές τις περιπτώσεις AsymAD. Η πρώτη ομάδα περιελάμβανε περιπτώσεις AsymAD συγκεντρωμένες πιο κοντά στον έλεγχο (n = 19), ενώ η δεύτερη ομάδα χαρακτηρίστηκε από περιπτώσεις AsymAD με προφίλ δείκτη πιο κοντά στο AD (n = 12).
(Α) Το επίπεδο έκφρασης (z-score) της ομάδας βιοδεικτών ΕΝΥ και στα 96 δείγματα στην κοόρτη αναπαραγωγής ΕΝΥ 1, συμπεριλαμβανομένου του AsymAD. Η ανάλυση της διακύμανσης με τη μεταδιόρθωση του Tukey χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας των αλλαγών αφθονίας πάνελ. (Β) Ανάλυση συσχέτισης του επιπέδου αφθονίας πρωτεϊνών πάνελ (z-score) με τη βαθμολογία MoCA και το συνολικό επίπεδο tau σε δείγματα ELISA Aβ1-42 και ΕΝΥ αντιγράφου 1. Εμφανίζεται ο συντελεστής συσχέτισης Pearson με τη σχετική τιμή P. (Γ) Το MDS 96 περιπτώσεων αντιγράφου 1 CSF βασίστηκε στα επίπεδα αφθονίας 29 επικυρωμένων δεικτών πάνελ, τα οποία άλλαξαν σημαντικά τόσο στα σύνολα δεδομένων ανακάλυψης όσο και στα σύνολα δεδομένων αντιγράφου 1 CSF [P <0,05 AD/control (CT)]. Αυτή η ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για τη διαίρεση της ομάδας AsymAD σε υποομάδες ελέγχου (n = 19) και AD (n = 12). (D) Η γραφική παράσταση του ηφαιστείου δείχνει τη διαφορική έκφραση όλων των πρωτεϊνών αντιγραφής 1 του ΕΝΥ με αλλαγή log2 φορές (άξονας x) σε σχέση με την -log10 στατιστική τιμή P μεταξύ των δύο υποομάδων AsymAD. Οι βιοδείκτες του πίνακα είναι έγχρωμοι. (Ε) Το επίπεδο αφθονίας αντιγραφής ΕΝΥ 1 των βιοδεικτών της ομάδας επιλογής εκφράζεται διαφορετικά μεταξύ των υποομάδων AsymAD. Η μετα-προσαρμοσμένη ανάλυση διακύμανσης του Tukey χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της στατιστικής σημαντικότητας.
Εξετάσαμε τη διαφορική έκφραση πρωτεΐνης μεταξύ αυτών των περιπτώσεων ελέγχου και των περιπτώσεων AsymAD που μοιάζουν με AD (Εικόνα 6D και Πίνακας S2L). Ο προκύπτων χάρτης ηφαιστείων δείχνει ότι 14 δείκτες πάνελ έχουν αλλάξει σημαντικά μεταξύ των δύο ομάδων. Οι περισσότεροι από αυτούς τους δείκτες είναι μέλη της σύναψης και του μεταβολισμού. Ωστόσο, το SOD1 και το πλούσιο σε μυριστοϋλιωμένη αλανίνη υπόστρωμα πρωτεϊνικής κινάσης C (MARCKS), τα οποία είναι μέλη της μυελίνης και των νευρογλοιακών ανοσολογικών ομάδων, αντίστοιχα, ανήκουν επίσης σε αυτήν την ομάδα (Εικόνα 6, D και E). Το αγγειακό πάνελ συνεισέφερε επίσης δύο δείκτες που μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα AsymAD που μοιάζει με AD, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης δέσμευσης ΑΕ 1 (AEBP1) και του μέλους της οικογένειας του συμπληρώματος C9. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των υποομάδων ελέγχου και των υποομάδων AsymAD τύπου AD στο ELISA AB1-42 (P = 0,38) και το p-tau (P = 0,28), αλλά υπήρξε πράγματι σημαντική διαφορά στο συνολικό επίπεδο ταυ (P = 0,0031 ) (Εικ. S7). Υπάρχουν αρκετοί δείκτες πίνακα που υποδεικνύουν ότι οι αλλαγές μεταξύ των δύο υποομάδων AsymAD είναι πιο σημαντικές από τα συνολικά επίπεδα tau (για παράδειγμα, YWHAZ, SOD1 και MDH1) (Εικόνα 6Ε). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το επικυρωμένο πάνελ μας μπορεί να περιέχει βιοδείκτες που μπορούν να προσδιορίσουν τον υποτύπο και τον πιθανό κίνδυνο διαστρωμάτωσης ασθενών με ασυμπτωματική νόσο.
Υπάρχει επείγουσα ανάγκη για εργαλεία βιοδεικτών που βασίζονται στο σύστημα για την καλύτερη μέτρηση και στόχευση της ποικίλης παθοφυσιολογίας πίσω από την AD. Αυτά τα εργαλεία αναμένεται όχι μόνο να αλλάξουν το διαγνωστικό μας πλαίσιο για την AD, αλλά και να προωθήσουν την υιοθέτηση αποτελεσματικών στρατηγικών θεραπείας ειδικά για τον ασθενή (1, 2). Για το σκοπό αυτό, εφαρμόσαμε μια αμερόληπτη ολοκληρωμένη προσέγγιση πρωτεϊνικής στον εγκέφαλο και το ΕΝΥ για τον εντοπισμό βιοδεικτών ΕΝΥ που βασίζονται στον ιστό που αντικατοπτρίζουν ένα ευρύ φάσμα παθοφυσιολογίας που βασίζεται στον εγκέφαλο. Η ανάλυσή μας παρήγαγε πέντε πίνακες βιοδεικτών ΕΝΥ, οι οποίοι (i) αντικατοπτρίζουν τις συνάψεις, τα αιμοφόρα αγγεία, τη μυελίνη, τη δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού και του μεταβολισμού. (ii) επιδεικνύουν ισχυρή αναπαραγωγιμότητα σε διαφορετικές πλατφόρμες ΚΜ· (iii) Εμφάνιση προοδευτικών αλλαγών που σχετίζονται με τη νόσο κατά τη διάρκεια των πρώιμων και όψιμων σταδίων της AD. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα αντιπροσωπεύουν ένα πολλά υποσχόμενο βήμα προς την ανάπτυξη ποικίλων, αξιόπιστων, προσανατολισμένων στον ιστό εργαλείων βιοδεικτών για την έρευνα της AD και τις κλινικές εφαρμογές.
Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την εξαιρετικά διατηρημένη οργάνωση του πρωτεώματος του δικτύου εγκεφάλου AD και υποστηρίζουν τη χρήση του ως άγκυρα για την ανάπτυξη βιοδεικτών βάσει συστήματος. Η ανάλυσή μας δείχνει ότι δύο ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων TMT-MS που περιέχουν εγκεφάλους AD και AsymAD έχουν ισχυρή σπονδυλωτή. Αυτά τα ευρήματα επεκτείνουν την προηγούμενη εργασία μας, καταδεικνύοντας τη διατήρηση των ισχυρών μονάδων περισσότερων από 2.000 εγκεφαλικών ιστών από πολλαπλές ανεξάρτητες κοόρτες στον μετωπιαίο, βρεγματικό και κροταφικό φλοιό (17). Αυτό το δίκτυο συναίνεσης αντικατοπτρίζει διάφορες αλλαγές που σχετίζονται με την ασθένεια που παρατηρούνται στην τρέχουσα έρευνα, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης των πλούσιων σε γλοία φλεγμονωδών μονάδων και της μείωσης των πλούσιων σε νευρώνες δομοστοιχείων. Όπως η τρέχουσα έρευνα, αυτό το δίκτυο μεγάλης κλίμακας διαθέτει επίσης σημαντικές σπονδυλωτές αλλαγές στο AsymAD, που δείχνουν μια ποικιλία διαφορετικής προκλινικής παθοφυσιολογίας (17).
Ωστόσο, μέσα σε αυτό το εξαιρετικά συντηρητικό πλαίσιο που βασίζεται στο σύστημα, υπάρχει πιο λεπτή βιολογική ετερογένεια, ειδικά μεταξύ των ατόμων στα πρώιμα στάδια της AD. Το πάνελ βιοδεικτών μας είναι σε θέση να απεικονίσει δύο υποομάδες στο AsymAD, οι οποίες καταδεικνύουν τη σημαντική διαφορική έκφραση πολλαπλών δεικτών ΕΝΥ. Η ομάδα μας μπόρεσε να επισημάνει τις βιολογικές διαφορές μεταξύ αυτών των δύο υποομάδων, οι οποίες δεν ήταν εμφανείς στο επίπεδο των βασικών βιοδεικτών AD. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, οι αναλογίες Aβ1-42/ολική ταυ αυτών των ατόμων AsymAD ήταν ασυνήθιστα χαμηλές. Ωστόσο, μόνο τα συνολικά επίπεδα tau ήταν σημαντικά διαφορετικά μεταξύ των δύο υποομάδων AsymAD, ενώ τα επίπεδα Aβ1-42 και p-tau παρέμειναν σχετικά συγκρίσιμα. Δεδομένου ότι η υψηλή ταυ ΕΝΥ φαίνεται να είναι καλύτερος προγνωστικός παράγοντας των γνωστικών συμπτωμάτων από τα επίπεδα Aβ1-42 (7), υποπτευόμαστε ότι οι δύο κοόρτες AsymAD μπορεί να έχουν διαφορετικούς κινδύνους εξέλιξης της νόσου. Δεδομένου του περιορισμένου μεγέθους δείγματος του AsymAD μας και της έλλειψης διαχρονικών δεδομένων, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να εξαχθούν με σιγουριά αυτά τα συμπεράσματα. Ωστόσο, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ένα πάνελ ΕΝΥ βασισμένου σε σύστημα μπορεί να ενισχύσει την ικανότητά μας να διαστρώνουμε αποτελεσματικά τα άτομα κατά το ασυμπτωματικό στάδιο της νόσου.
Συνολικά, τα ευρήματά μας υποστηρίζουν τον ρόλο πολλαπλών βιολογικών λειτουργιών στην παθογένεση της AD. Ωστόσο, ο απορυθμισμένος ενεργειακός μεταβολισμός έγινε το εξέχον θέμα και των πέντε επικυρωμένων πλαισίων ετικετών μας. Οι μεταβολικές πρωτεΐνες, όπως η φωσφοριβοσυλοτρανσφεράση υποξανθίνης-γουανίνης 1 (HPRT1) και η γαλακτική αφυδρογονάση Α (LDHA), είναι οι πιο αξιόπιστα επικυρωμένοι συναπτικοί βιοδείκτες, υποδεικνύοντας ότι η αύξηση του AD CSF είναι φύλο υψηλής αναπαραγωγής. Τα αιμοφόρα αγγεία και τα γλοιακά μας πάνελ περιέχουν επίσης αρκετούς δείκτες που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των οξειδωτικών ουσιών. Αυτά τα ευρήματα συνάδουν με τον βασικό ρόλο που παίζουν οι μεταβολικές διεργασίες σε ολόκληρο τον εγκέφαλο, όχι μόνο για την κάλυψη της υψηλής ενεργειακής ζήτησης των νευρώνων, αλλά και για την κάλυψη της υψηλής ενεργειακής ζήτησης των αστροκυττάρων και άλλων νευρογλοιακών κυττάρων (17, 48). Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι οι αλλαγές στο δυναμικό οξειδοαναγωγής και η διακοπή των ενεργειακών οδών μπορεί να είναι ο βασικός σύνδεσμος μεταξύ πολλών βασικών διεργασιών που εμπλέκονται στην παθογένεση της AD, συμπεριλαμβανομένων των μιτοχονδριακών διαταραχών, της φλεγμονής που προκαλείται από τη γλοία και της αγγειακής βλάβης (49). Επιπλέον, οι βιοδείκτες του μεταβολικού εγκεφαλονωτιαίου υγρού περιέχουν μεγάλο αριθμό διαφορικά πλούσιων πρωτεϊνών μεταξύ των υποομάδων ελέγχου μας και της υποομάδας AsymAD που μοιάζει με AD, υποδηλώνοντας ότι η διακοπή αυτών των ενεργειακών και οξειδοαναγωγικών οδών μπορεί να είναι κρίσιμη στο προκλινικό στάδιο της νόσου.
Οι διαφορετικές τάσεις του πάνελ του εγκεφάλου και του εγκεφαλονωτιαίου υγρού που έχουμε παρατηρήσει έχουν επίσης ενδιαφέρουσες βιολογικές επιπτώσεις. Οι συνάψεις και τα μεταβολώματα πλούσια σε νευρώνες δείχνουν μειωμένα επίπεδα στον εγκέφαλο AD και αυξημένη αφθονία στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Δεδομένου ότι οι νευρώνες είναι πλούσιοι σε μιτοχόνδρια που παράγουν ενέργεια στις συνάψεις για να παρέχουν ενέργεια για τα πολυάριθμα εξειδικευμένα σήματα τους (50), αναμένεται η ομοιότητα των προφίλ έκφρασης αυτών των δύο ομάδων νευρώνων. Η απώλεια νευρώνων και η εξώθηση κατεστραμμένων κυττάρων μπορεί να εξηγήσει αυτές τις τάσεις του πάνελ του εγκεφάλου και του ΕΝΥ σε μεταγενέστερη ασθένεια, αλλά δεν μπορούν να εξηγήσουν τις πρώιμες αλλαγές του πάνελ που παρατηρούμε (13). Μια πιθανή εξήγηση για αυτά τα ευρήματα στην πρώιμη ασυμπτωματική νόσο είναι το ανώμαλο συναπτικό κλάδεμα. Νέα στοιχεία σε μοντέλα ποντικών υποδηλώνουν ότι η προκαλούμενη από μικρογλοία συναπτική φαγοκυττάρωση μπορεί να ενεργοποιηθεί ανώμαλα στη ΝΑ και να οδηγήσει σε πρώιμη απώλεια συνάψεων στον εγκέφαλο (51). Αυτό το απορριπτόμενο συναπτικό υλικό μπορεί να συσσωρευτεί στο ΕΝΥ, γι' αυτό παρατηρούμε την αύξηση του ΕΝΥ στο πλαίσιο του νευρώνα. Το συναπτικό κλάδεμα που προκαλείται από το ανοσοποιητικό μπορεί επίσης να εξηγήσει εν μέρει την αύξηση των γλοιακών πρωτεϊνών που παρατηρούμε στον εγκέφαλο και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό σε όλη τη διαδικασία της νόσου. Εκτός από το συναπτικό κλάδεμα, οι συνολικές ανωμαλίες στην εξωκυτταρική οδό μπορεί επίσης να οδηγήσουν σε διαφορετικές εκφράσεις του εγκεφάλου και του ΕΝΥ νευρωνικών δεικτών. Ένας αριθμός μελετών έχει δείξει ότι το περιεχόμενο των εξωσωμάτων στην παθογένεση του εγκεφάλου AD έχει αλλάξει (52). Η εξωκυτταρική οδός εμπλέκεται επίσης στον πολλαπλασιασμό του Αβ (53, 54). Αξίζει να σημειωθεί ότι η καταστολή της εξωσωματικής έκκρισης μπορεί να μειώσει την παθολογία που μοιάζει με AD σε μοντέλα διαγονιδιακών ποντικών με AD (55).
Ταυτόχρονα, η πρωτεΐνη στο αγγειακό πάνελ έδειξε μέτρια αύξηση στον εγκέφαλο AD, αλλά σημαντικά μειωμένη στο ΕΝΥ. Η δυσλειτουργία του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB) μπορεί να εξηγήσει εν μέρει αυτά τα ευρήματα. Πολλές ανεξάρτητες μεταθανάτιες μελέτες σε ανθρώπους έχουν δείξει διάσπαση του BBB στην AD (56, 57). Αυτές οι μελέτες επιβεβαίωσαν διάφορες μη φυσιολογικές δραστηριότητες που περιβάλλουν αυτό το σφιχτά σφραγισμένο στρώμα ενδοθηλιακών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης της διαρροής των τριχοειδών του εγκεφάλου και της περιαγγειακής συσσώρευσης πρωτεϊνών που μεταδίδονται στο αίμα (57). Αυτό μπορεί να παρέχει μια απλή εξήγηση για τις αυξημένες αγγειακές πρωτεΐνες στον εγκέφαλο, αλλά δεν μπορεί να εξηγήσει πλήρως την εξάντληση αυτών των ίδιων πρωτεϊνών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Μια πιθανότητα είναι ότι το κεντρικό νευρικό σύστημα απομονώνει ενεργά αυτά τα μόρια για να λύσει το πρόβλημα της αυξημένης φλεγμονής και του οξειδωτικού στρες. Η μείωση σε ορισμένες από τις πιο σοβαρές πρωτεΐνες του ΕΝΥ σε αυτό το πλαίσιο, ειδικά εκείνων που εμπλέκονται στη ρύθμιση των λιποπρωτεϊνών, σχετίζεται με την αναστολή των επιβλαβών επιπέδων φλεγμονής και τη νευροπροστατευτική διαδικασία των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου. Αυτό ισχύει για την Paroxonase 1 (PON1), ένα ένζυμο που δεσμεύει τις λιποπρωτεΐνες που είναι υπεύθυνο για τη μείωση των επιπέδων οξειδωτικού στρες στην κυκλοφορία (58, 59). Ο πρόδρομος άλφα-1-μικροσφαιρίνης/μπικουνίνης (AMBP) είναι ένας άλλος σημαντικά μειωμένος δείκτης της αγγειακής ομάδας. Είναι ο πρόδρομος του μεταφορέα λιπιδίων μπικουνίνη, η οποία εμπλέκεται επίσης στην καταστολή της φλεγμονής και στη νευρολογική προστασία (60, 61).
Παρά τις διάφορες ενδιαφέρουσες υποθέσεις, η αδυναμία άμεσης ανίχνευσης μηχανισμών βιοχημικής νόσου είναι ένας πολύ γνωστός περιορισμός της ανάλυσης πρωτεομικής που βασίζεται στην ανακάλυψη. Ως εκ τούτου, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να καθοριστούν με σιγουριά οι μηχανισμοί πίσω από αυτά τα πάνελ βιοδεικτών. Προκειμένου να προχωρήσουμε προς την ανάπτυξη κλινικής ανάλυσης με βάση την ΠΣ, η μελλοντική κατεύθυνση απαιτεί επίσης τη χρήση στοχευμένων ποσοτικών μεθόδων για επαλήθευση βιοδεικτών μεγάλης κλίμακας, όπως η επιλεκτική ή παράλληλη παρακολούθηση αντιδράσεων (62). Πρόσφατα χρησιμοποιήσαμε την παράλληλη παρακολούθηση αντιδράσεων (63) για να επικυρώσουμε πολλές από τις αλλαγές πρωτεΐνης του ΕΝΥ που περιγράφονται εδώ. Αρκετοί στόχοι πάνελ προτεραιότητας ποσοτικοποιούνται με σημαντική ακρίβεια, συμπεριλαμβανομένων των YWHAZ, ALDOA και SMOC1, οι οποίοι χαρτογραφούνται στα πάνελ σύναψης, μεταβολισμού και φλεγμονής μας, αντίστοιχα (63). Η Ανεξάρτητη Απόκτηση Δεδομένων (DIA) και άλλες στρατηγικές που βασίζονται σε MS μπορεί επίσης να είναι χρήσιμες για την επαλήθευση του στόχου. Bud et al. (64) Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι υπάρχει σημαντική επικάλυψη μεταξύ των βιοδεικτών AD που προσδιορίζονται στο σύνολο δεδομένων ανακάλυψης CSF και του ανεξάρτητου συνόλου δεδομένων DIA-MS, το οποίο αποτελείται από σχεδόν 200 δείγματα CSF από τρεις διαφορετικές ευρωπαϊκές κοόρτες. Αυτές οι πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν τη δυνατότητα των πάνελ μας να μετατραπούν σε αξιόπιστη ανίχνευση βασισμένη σε MS. Η παραδοσιακή ανίχνευση με βάση τα αντισώματα και το απταμερές είναι επίσης σημαντική για την περαιτέρω ανάπτυξη βασικών βιοδεικτών AD. Λόγω της χαμηλής αφθονίας του ΕΝΥ, είναι πιο δύσκολο να ανιχνευθούν αυτοί οι βιοδείκτες χρησιμοποιώντας μεθόδους MS υψηλής απόδοσης. Το NEFL και το NRGN είναι δύο τέτοια παραδείγματα βιοδεικτών ΕΝΥ χαμηλής αφθονίας, τα οποία αντιστοιχίζονται στο πάνελ στην περιεκτική μας ανάλυση, αλλά δεν μπορούν να ανιχνευθούν αξιόπιστα χρησιμοποιώντας τη μοναδική μας στρατηγική MS. Οι στρατηγικές στόχευσης που βασίζονται σε πολλαπλά αντισώματα, όπως το PEA, μπορεί να προάγουν τον κλινικό μετασχηματισμό αυτών των δεικτών.
Συνολικά, αυτή η μελέτη παρέχει μια μοναδική προσέγγιση πρωτεομικής για την αναγνώριση και επαλήθευση βιοδεικτών AD ΕΝΥ με βάση διαφορετικά συστήματα. Η βελτιστοποίηση αυτών των πλαισίων δεικτών σε πρόσθετες κοόρτες AD και πλατφόρμες MS μπορεί να αποδειχθεί πολλά υποσχόμενη για την προώθηση της διαστρωμάτωσης και θεραπείας του κινδύνου AD. Μελέτες που αξιολογούν το διαμήκη επίπεδο αυτών των πλαισίων με την πάροδο του χρόνου είναι επίσης κρίσιμες για να προσδιοριστεί ποιος συνδυασμός δεικτών στρωματοποιεί καλύτερα τον κίνδυνο πρώιμης νόσου και τις αλλαγές στη σοβαρότητα της νόσου.
Εκτός από τα 3 δείγματα που αντιγράφηκαν από το ΕΝΥ, όλα τα δείγματα ΕΝΥ που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη συλλέχθηκαν υπό την αιγίδα του Emory ADRC ή στενά συνδεδεμένων ερευνητικών ιδρυμάτων. Συνολικά τέσσερα σετ δειγμάτων ΕΝΥ Emory χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις πρωτεομικές μελέτες. Η κοόρτη του ΕΝΥ βρέθηκε να περιέχει δείγματα από 20 υγιείς μάρτυρες και 20 ασθενείς με AD. Το αντίγραφο 1 του ΕΝΥ περιλαμβάνει δείγματα από 32 υγιείς μάρτυρες, 31 άτομα AsymAD και 33 άτομα AD. Το αντίγραφο 2 του ΕΝΥ περιέχει 147 μάρτυρες και 150 δείγματα AD. Η κοόρτη πολλαπλών ασθενειών αναπαραγωγής ΕΝΥ 4 περιελάμβανε 18 μάρτυρες, 17 AD, 19 ALS, 13 PD και 11 δείγματα FTD. Σύμφωνα με τη συμφωνία που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικής Αναθεώρησης του Πανεπιστημίου Emory, όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη Emory έλαβαν ενημερωμένη συγκατάθεση. Σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες βέλτιστης πρακτικής του Εθνικού Ινστιτούτου Γήρανσης του 2014 για τα Κέντρα Αλτσχάιμερ (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), το εγκεφαλονωτιαίο υγρό συλλέχθηκε και αποθηκεύτηκε με οσφυϊκή παρακέντηση. Οι ασθενείς ελέγχου και AsymAD και AD έλαβαν τυποποιημένη γνωστική αξιολόγηση στη Γνωσιακή Νευρολογική Κλινική Emory ή στην Goizueta ADRC. Τα δείγματα εγκεφαλονωτιαίου υγρού τους δοκιμάστηκαν από το INNO-BIA AlzBio3 Luminex για ανάλυση ELISA Aβ1-42, ολική tau και p-tau (65 ). Οι τιμές ELISA χρησιμοποιούνται για την υποστήριξη της διαγνωστικής ταξινόμησης των υποκειμένων με βάση καθιερωμένα κριτήρια αποκοπής βιοδεικτών AD (66, 67). Τα βασικά δημογραφικά και διαγνωστικά δεδομένα για άλλες διαγνώσεις ΕΝΥ (FTD, ALS και PD) λαμβάνονται επίσης από το Emory ADRC ή συνδεδεμένα ερευνητικά ιδρύματα. Τα συνοπτικά μεταδεδομένα περίπτωσης για αυτές τις περιπτώσεις Emory CSF βρίσκονται στον Πίνακα S1A. Τα χαρακτηριστικά της κοόρτης αντιγραφής 3 του ελβετικού CSF έχουν δημοσιευτεί στο παρελθόν (45).
Το CSF βρήκε το δείγμα. Προκειμένου να αυξηθεί το βάθος της ανακάλυψης του συνόλου δεδομένων του ΕΝΥ, πραγματοποιήθηκε ανοσολογική κατανάλωση πρωτεϊνών υψηλής αφθονίας πριν από την θρυψίνη. Εν ολίγοις, 130 μl ΕΝΥ από 40 μεμονωμένα δείγματα ΕΝΥ και ίσος όγκος (130 μl) ρητίνης εξάντλησης πρωτεΐνης High Select Top14 Abundance (Thermo Fisher Scientific, A36372) τοποθετήθηκαν σε μια στήλη περιστροφής (Thermo Fisher Scientific, A89868) στο δωμάτιο. θερμοκρασία Επώαση). Μετά από περιδίνηση για 15 λεπτά, φυγοκεντρήστε το δείγμα στα 1000 g για 2 λεπτά. Μια συσκευή υπερφυγόκεντρου φίλτρου 3Κ (Millipore, UFC500396) χρησιμοποιήθηκε για τη συμπύκνωση του δείγματος εκροής με φυγοκέντρηση στα 14.000 g για 30 λεπτά. Αραιώστε όλους τους όγκους του δείγματος στα 75 μl με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης αξιολογήθηκε με τη μέθοδο δικινχονικού οξέος (BCA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Thermo Fisher Scientific). Το ανοσοεξαντλημένο ΕΝΥ (60 μl) και από τα 40 δείγματα υποβλήθηκε σε πέψη με λυσυλενδοπεπτιδάση (LysC) και θρυψίνη. Εν συντομία, το δείγμα ανήχθη και αλκυλιώθηκε με 1,2 μl 0,5 Μ τρις-2(-καρβοξυαιθυλο)-φωσφίνης και 3 μl 0,8 Μ χλωροακεταμιδίου στους 90°C για 10 λεπτά, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε υπερήχους σε λουτρό νερού για 15 λεπτά. Το δείγμα αραιώθηκε με 193 μl ρυθμιστικού διαλύματος ουρίας 8 Μ [ουρία 8 Μ και 100 mM NaHPO4 (ρΗ 8,5)] σε τελική συγκέντρωση 6 Μ ουρίας. Το LysC (4,5 μg, Wako) χρησιμοποιείται για ολονύκτια πέψη σε θερμοκρασία δωματίου. Το δείγμα στη συνέχεια αραιώθηκε σε 1 Μ ουρία με 50 mM διττανθρακικό αμμώνιο (ABC) (68). Προσθέστε ίση ποσότητα (4,5 μg) θρυψίνης (Promega) και στη συνέχεια επωάστε το δείγμα για 12 ώρες. Οξινίστε το χωνεμένο διάλυμα πεπτιδίου σε τελική συγκέντρωση 1% μυρμηκικού οξέος (FA) και 0,1% τριφθοροξικού οξέος (TFA) (66) και στη συνέχεια αφαλατώστε με μια στήλη Sep-Pak C18 50 mg (Waters) όπως περιγράφεται παραπάνω (25) . Το πεπτίδιο στη συνέχεια εκλούστηκε σε 1 ml ακετονιτριλίου 50% (ACN). Για την τυποποίηση της ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνών σε παρτίδες (25), δείγματα 100 μl και από τα 40 δείγματα CSF συνδυάστηκαν για να δημιουργηθεί ένα μικτό δείγμα, το οποίο στη συνέχεια χωρίστηκε σε πέντε δείγματα παγκόσμιου εσωτερικού προτύπου (GIS) (48). Όλα τα μεμονωμένα δείγματα και τα συνδυασμένα πρότυπα στεγνώνουν με κενό υψηλής ταχύτητας (Labconco).
Το CSF αντιγράφει το δείγμα. Ο Dayon και οι συνεργάτες του έχουν περιγράψει προηγουμένως την εξάντληση του ανοσοποιητικού και την πέψη των δειγμάτων αντιγράφων 3 του ΕΝΥ (45, 46). Τα υπόλοιπα αντίγραφα δείγματα δεν είχαν εξασθενήσει μεμονωμένα ανοσοποιητικά. Χώνεψε αυτά τα δείγματα που δεν έχουν αφαιρεθεί σε θρυψίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως (17). Για κάθε επαναλαμβανόμενη ανάλυση, δείγματα 120 μl του εκλουσμένου πεπτιδίου από κάθε δείγμα συγκεντρώθηκαν και χωρίστηκαν σε κλάσματα ίσου όγκου για να χρησιμοποιηθούν ως το σημασμένο με TMT παγκόσμιο εσωτερικό πρότυπο (48). Όλα τα μεμονωμένα δείγματα και τα συνδυασμένα πρότυπα στεγνώνουν με κενό υψηλής ταχύτητας (Labconco). Προκειμένου να ενισχυθεί το σήμα της χαμηλής αφθονίας πρωτεΐνης CSF, συνδυάζοντας 125 μl από κάθε δείγμα, παρασκευάστηκε ένα «βελτιωμένο» δείγμα για κάθε επαναληπτική ανάλυση [δηλαδή, ένα βιολογικό δείγμα που μιμείται το ερευνητικό δείγμα, αλλά η διαθέσιμη ποσότητα είναι πολύ μεγαλύτερο (37, 69)] συγχωνεύθηκε σε ένα μικτό δείγμα ΕΝΥ (17). Το μικτό δείγμα στη συνέχεια αφαιρέθηκε ανοσοποιητικά χρησιμοποιώντας 12 ml ρητίνης αφαίρεσης πρωτεΐνης High Select Top14 Abundance (Thermo Fisher Scientific, A36372), χωνεύτηκε όπως περιγράφεται παραπάνω και συμπεριλήφθηκε στην επακόλουθη πολλαπλή επισήμανση ΤΜΤ.
Ώρα ανάρτησης: 27 Αυγούστου 2021